sábado, 31 de agosto de 2013

os recuerdos a muy largo plazo, tales como el condicionamiento del miedo, se almacenan como el patrón de agujeros en la red perineuronal

Una hipótesis y los experimentos para probar que propone que los recuerdos a muy largo plazo, tales como el condicionamiento del miedo, se almacenan como el patrón de agujeros en la red perineuronal (PNN), una ECM especializado que envuelve las neuronas maduras y limita la formación de sinapsis. El 3D entrelazamiento de PNN y sinapsis podría ser reflejado por la sección de serie EM. Vidas de PNN vs componentes intrasynaptic se compararían con pulso-caza 15 N etiquetado en ratones y 14 C contenido en los cerebros de cadáveres humanos. Indicadores codificados genéticamente y anticuerpos antineoepitope deben mejorar la resolución espacial y temporal de la actividad in vivo de proteasas que localmente erosionan PNN. Otras técnicas sugeridas incluyen KOs genéticos, mejores inhibidores farmacológicos, y un reportero instantánea codificada genéticamente que incorporen todo el patrón de actividad a lo largo de un gran conjunto de neuronas en un momento definido de forma precisa por la iluminación de la activación, la unidad de expresión de los genes efectores para marcar las células , y permitir la excitación selectiva, inhibición, o la ablación para probar su importancia funcional. El reportero instantánea debe permitir la inhibición más precisa o potenciación de la erosión del PNN para comparar con consecuencias conductuales. Por último, la biosíntesis de los componentes PNN y proteasas se va a examinar.
Un problema importante en la comprensión de la memoria es la forma en que puede ser muy duradero y estable desde la primera infancia hasta la muerte, a pesar de las interrupciones masivas en estado cerebral como extremo como comas prolongados. Candidatos actuales destacados para sustratos moleculares para el almacenamiento de la memoria a largo plazo se han centrado en macromoléculas como proteínas dependiente de calmodulina quinasa II (CaMKII), junto con el receptor de NMDA ( 1 ) y la proteína fosfatasa 2A ( 2 ), la proteína quinasa M zeta (PKMζ) ( 3 ), y el elemento de poliadenilación citoplasmática proteína de unión (CPEB) ( 4 ), todos los cuales están dentro de las espinas postsinápticos. Para retener la información a pesar de recambio metabólico, todos estos candidatos necesitan tener algún tipo de interruptor biestable (por ejemplo, el estado de fosforilación o conformación priónica) y un mecanismo por el cual las copias más antiguas de la molécula pase de su estado a nuevos ejemplares para preservar la información. Un problema importante es que las moléculas intracelulares individuales suelen durar a lo sumo unos pocos días antes de ser entregado. Por lo tanto, la información tendría que sobrevivir siendo copiados decenas de miles de veces en un ser humano de larga duración, a pesar de las interrupciones metabólicas. Esta fidelidad robusto sería extremadamente difícil de ingeniero. Incluso la memoria del ordenador dinámico con refresco sofisticado y circuitos de corrección de errores no puede hacer frente incluso un hipo momentánea en su fuente de alimentación. En cambio, el almacenamiento de información a largo plazo en ambos equipos y las civilizaciones humanas es necesario escribir la información en los medios de almacenamiento físicamente estables (por ejemplo, discos magnéticos, tabletas de arcilla o papel libre de ácido), que no requieren frecuentes recopiado dependiente de la energía. Aparte de algunos constituyentes de poros nucleares, todos los conocen muy larga duración proteínas son los componentes de ECM insolubles como cristalina, elastina, colágeno y proteoglicanos ( 5 ), que ganan estabilidad extensa reticulación y la lejanía de la maquinaria de degradación intracelular, tales como proteasomas, lisosomas y la autofagia.
Una matriz de proteoglicano-rica llama la red Perineuronales (PNN) de largo se ha sabido que la vaina neuronas del SNC maduros ( figuras 1. y 2 ), con las sinapsis que forman a través de huecos en el PNN ( 6     - 12 ). El PNN está inicialmente prevista al final de los períodos críticos en el cableado de las entradas sensoriales y puede tener contribuciones de las neuronas y la glía ( 13 ). Experimental interrupción global de la PNN puede volver a abrir dichos períodos críticos, y por lo tanto, el PNN se considera generalmente para restringir la plasticidad sináptica ( 14 , 15 ). Las enzimas endógenas que pueden digerir el PNN, tales como metaloproteinasas de la matriz (MMPs, especialmente MMP-9), son conocidos por ser importante en alguna manera para la plasticidad sináptica ( 7 , 16 , 17 ). A pesar de la enorme literatura sobre PNN y las enzimas que degradan, no hay consenso claro mecanicista ha surgido para explicar su papel importante en la plasticidad sináptica y memoria. Gran parte del problema se debe a que los experimentos muestran efectos sobre el comportamiento in vivo dependen de las interrupciones de la PNN o sus enzimas degradadoras de baja resolución espacial y temporal, dejando la posibilidad de que estas moléculas no son más permisivos y no portadores de información detallada. Mucho experimentos de más alta resolución se han hecho en synaptoneurosomes, rebanadas, o culturas [por ejemplo, que muestra que la MMP-9 se traduce a nivel local ( 18 ) y con rapidez secretada en las sinapsis en respuesta a la actividad ( 19  - 21 ), inhibidores de MMP que evitan potenciación sináptica de fase tardía ( 16    - 20), y que las autoridades locales de hinchamiento de la MMP-9 en las espinas pueden provocar aumento columna vertebral y la potenciación sináptica ( 19   - 22 )], pero estas manipulaciones pueden aún no estar vinculado a comportamientos específicos o recuerdos. Tendrán que ser desarrollado para probar la hipótesis de que muy memorias a largo plazo se almacenan en el patrón y el tamaño de los agujeros en el PNN y que los agujeros se crean o amplían por los enzimas mencionados anteriormente dinámicamente nuevas técnicas. En este punto de vista, la PNN es como una tarjeta perforada, increíblemente complicadas en 3D, en el que la posición y el tamaño de los agujeros preservar la ubicación a largo plazo y la fuerza de las sinapsis ( . Fig. S1 y S1 Película ).
. Figura 2.
La estructura de la PNN. Ácido hialurónico, secretada por membrana HA sintasa (HAS), se une a los miembros de la familia lectican (agrecano, brevican, versicano, y neurocan) y se reticula por las proteínas de enlace y tenascina-R para formar agregados supramoleculares en la superficie de neuronas. Reproducido de ref. 80 con permiso de John Wiley & Sons, Inc. CS-GAG, sulfato de condroitina - glicosaminoglicanos.
Las bases moleculares y celulares de muy largo plazo plasticidad sináptica y la memoria son algunas de las preguntas más céntricas y controversial de la neurociencia. También, PNNS y MMPs han sido fuertemente implicado en muchos neuropatologías que van desde la lesión traumática, cableado incorrecto durante los períodos críticos, y la epileptogénesis, plasticidad relacionado con la adicción a la enfermedad de Alzheimer ( 6 , 7 , 9 , 11 ). El miedo acondicionado es un modelo animal importante para la ansiedad y el trastorno de estrés postraumático en los seres humanos ( 23 , 24 ). Las funciones comparativas de la PNN entre las especies (por ejemplo, Drosophila y Caenorhabditis elegans) se han descuidado. Como se señaló anteriormente, revisiones en el PNN proponen permisivas, funciones de apoyo, tales como la inhibición de crecimiento de neuritas, la formación de una barrera física a nuevos contactos, que sirve como un andamio para otras moléculas inhibitorias, integrinas de unión, lo que limita la movilidad del receptor de AMPA, reduciendo el estrés oxidativo, y iones de tamponamiento ( 6 ​​, 8 , 10 , 11 ). Tales papeles son algo análoga a la importancia del aislamiento en el cableado dentro de un ordenador: esencial para la función pero no en donde se almacenan dinámicamente bytes. Lo más cerca que la declaración previa a la hipótesis actual es la siguiente: "[l] a matriz extracelular en las sinapsis en el cerebro puede tener una función similar [como en la unión neuromuscular] y podría mantener la conectividad global a pesar de las idas y venidas de las moléculas en el interior neuronas "( 25 ). Esta declaración de un capítulo por Sejnowski ( 25 ) en un libro titulado Lo que creemos, pero no puedo probarlo era muy perspicaz, pero no dio detalles de la mecánica de cómo el ECM puede guardar la información. La única prueba experimental propuesto era que la interrupción de la MEC podría interferir con la memoria, para los que no es (y ya fue) mucha evidencia ( 6 , 12 , 14  -16 ), pero la evidencia no es lo suficientemente incisiva para ser convincente. Mientras tanto, las revisiones de las MMP en la plasticidad sináptica y el aprendizaje concluyen que los sustratos clave y los mecanismos aguas abajo siguen sin estar claros ( 7 , 16 , 26 ). En este artículo, me propongo experimentos para probar esta hipótesis y tratar de detallar cómo van a mejorar en aquellas hipótesis en la literatura. Una metáfora de la PNN estable localizar una sinapsis es en la fig. S1 .

Determinar la Relación Entre 3D PNN y sinapsis por serie Block Face exploración EM

Supuestos importantes de mi hipótesis son que el PNN forma una barrera continua que envuelve las neuronas pertinentes durante el período crítico de cierre de cada parte del cerebro y que el PNN permite las conexiones sinápticas entre neuronas a través de los agujeros de tamaño para adaptarse a los requisitos de cada sinapsis. Aunque la literatura publicada incluye imágenes mucho óptica de la PNN, hay muy pocos de sección delgada EM imágenes de alta calidad ( 27 ) y no reconstrucciones 3D que revelan la ultraestructura del PNN de consejos dendríticas a través del soma al final axonal. Propongo alta resolución-EM reconstrucción para la visualización 3D usando cara del bloque de exploración en serie EM (SBFSEM) (28 ) con varias opciones de destacar la PNN. El PNN se ha marcado con biotina Vicia villosa aglutinina (VVA) y Wisteria floribunda aglutinina (WFA) ( 29  - 31 ) ( Fig. 1. ). Propongo para etiquetar la PNN en rodajas de cerebro fijos con eosina-conjugado VVA y WFA, iluminar las etiquetas eosina para photooxidize diaminobencidina, y localmente generan osmiófilo precipitados de SBFSEM ( 32 ). Debido a que el PNN es extracelular, no será necesaria permeabilización de la membrana con detergentes, y por lo tanto, ultraestructura será bien conservada. Un enfoque alternativo sería la creación de vectores virales que codifican las proteínas PNN genéticamente fusionados a mini generador de oxígeno singlete (miniSOG) ( 33) o el incremento de ascorbato peroxidasa (APEX) ( 34 ) flanqueado con sitios loxP. Estos vectores virales entonces serían inyectados antes o durante la deposición PNN ( 35 ) en ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre en la amígdala (disponible de Jackson Laboratory), y por lo tanto, miniSOG o fusiones APEX se incorporan en el PNN en desarrollo. Diaminobencidina precipita para SBFSEM se generaría en las secciones fijas por foto-oxidación o reacción de la peroxidasa, respectivamente. El método de etiquetado genética es más laboriosa que la tinción de lectina de PNN endógena, pero ofrece la selectividad para los componentes específicos de la proteína (mientras que las lectinas ponen de relieve las cadenas laterales de hidratos de carbono), evita preocupaciones acerca de la difusibilidad de lectinas en secciones fijas, y también debe revelar las proteínas nacientes PNN en tránsito a través de la vía secretora en diferentes células ( 36 ).

Determinar la edad de las proteínas en PNN Vs.Hendidura sináptica

Utilice el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en mamíferos y Proteómica MS para Medir tiempos de vida de las proteínas dentro de las sinapsis Vs. la PNN y encontrar las proteínas de más larga vida.

Una clave postulado de mi hipótesis es que la PNN contiene moléculas que no gire después de su depósito inicial. La vida útil de los componentes relativos a las proteínas PNN intrasynaptic nunca parece haber sido medido experimentalmente, a pesar de una larga vida útil para el PNN es plausible por analogía a otros ECMs de larga duración ( 5 , 25 ). Treonina tritiada se informó a entregar con vidas medias bifásicas de 13 y 38 d en el total de las glicoproteínas del cerebro en cerebro de rata adulta, pero no hay radiactividad incorporada en las proteínas unidas a sulfato de condroitina y el sulfato de heparina ( 37 ), lo que implica muy poco volumen de negocio de los componentes de la PNN. Sugiero un enfoque basado en isótopos estables de etiquetado de los aminoácidos en mamíferos seguido de la tecnología de identificación de masas espectroscópicas multidimensional proteínas (MudPIT). Estos métodos se han utilizado para mostrar que las proteínas sinápticas cambian significativamente en abundancia después de la privación de la entrada sensorial a la corteza barril en ratones ( 38 ) y que algunas proteínas de poro nucleares son inesperadamente muy larga duración ( 39 ). Al igual que en estos estudios, las madres y las crías se alimentan 15 N Chow hasta que los ratones jóvenes son> 95% 15 N. En el día postnatal 45, el tiempo suficiente para la maduración completa de la PNN en la amígdala ( 35 ), los animales se mataron, y PNNS y sinaptosomas se aíslan mediante procedimientos establecidos ( 38 , 40 ) de diferentes partes del cerebro para MudPIT. Esta muestra sirve como t = 0 referencia para máximo 15 N etiquetado. Los animales restantes se cambiaron a 14 N Chow, murieron 2 d o 1, 4, 18, ​​o 78 semanas más tarde, y se procesan de manera similar. El punto de tiempo final puede tener que adelantar si los ratones no parece que sobrevivirían al fondo de escala. Espero que los 14 N / 15 N razones para dar las tasas de rotación de decenas de miles de proteínas distintas, plenamente identificados en el PNN y cientos de sinapsis representados por los sinaptosomas. Esta información debe ser de enorme valor a largo plazo, incluso si mi hipótesis es correcta o simplificada. Experiencias piloto verificación de preparación de muestras y MudPIT podrían hacerse en el control 14 N animales. Por ejemplo, las muestras PNN necesitarán desglicosilación enzimática antes de MudPIT. Sinaptosomas pueden necesitar la exposición a la condroitinasa para eliminar PNN residual. Tenga en cuenta también que, a diferencia de la propia PNN, las enzimas que degradan la PNN es probable que se girando rápidamente a lo largo, que se dio a entender por sus sobre regulación y locales minutos traducción agudos después de la activación sináptica ( 18 , 19 , 21 ).

Medición del volumen de negocios de PNN Vs. Proteínas sinaptosomales en humanos usando 14 C Dating.

Todos los seres humanos nacidos entre 1955 y 1963 se sometieron a un pulso de 14 C de las pruebas atmosféricas de armas nucleares, y por lo tanto, las muestras de tejido que contienen> 5 g de carbono pueden ser analizados por su fecha de la biosíntesis de con una precisión de aproximadamente ± 2 y. Esta técnica establecida ( 41  - 43 ) ha dado muchos resultados importantes, como el hecho de que la práctica totalidad del ADN en la corteza cerebral es casi tan antigua como el individuo, por lo tanto, la división celular postnatal es cuantitativamente insignificante. Sin embargo, tales citas nunca se ha aplicado a las proteínas o PNN sináptica. Me propongo utilizar el acelerador de MS y que data del PNN y muestras sinaptosomales preparados de diversas regiones del cerebro humano postmortem, incluyendo la amígdala. Las ventajas de estos experimentos son el espacio de tiempo multidecade retrospectiva accesible y la relación directa con la memoria humana, la desventaja es que no creo que para resolver las especies o los tiempos de vida de menos de varios años moleculares individuales. Una vez más, se necesitarán experiencias piloto para evaluar y reducir la magnitud de la contaminación cruzada entre PNN y sinaptosomas, la cantidad de carbono nuevo introducido por el procedimiento de aislamiento, y la cantidad de tejido de entrada necesaria para obtener el mínimo de 5 g de carbono. Si, por alguna razón, los experimentos C 14 demuestran inviable, la medición de racemización aspartato proporciona otra forma establecida de nacimiento-datación ( 5 , 44 ).

Imagen proteasa Activación con indicadores codificados genéticamente Después de una potenciación a largo plazo o Paradigm Learning

Una prueba ideal de la hipótesis sería que (i) monitorear continuamente la actividad de la proteasa con (ii)de alta resolución de tiempo y espacio en la mayor parte de la zona correspondiente del cerebro (por ejemplo, la amígdala), (iii) en el animal intacto durante un paradigma de aprendizaje apropiado (por ejemplo, el condicionamiento del miedo). A pesar de esta triple corona todavía no es posible, los indicadores codificados genéticamente de actividad de la proteasa deben permitir que todos los pares posibles de los criterios que deben cumplir. Monitoreo de MMP-2/-9 actividad requeriría la actualización de un informado FRET indicador ( 45 ) para la MMP-14 mediante la instalación de una mejor MMP-2/-9 sustrato, probablemente la secuencia de aminoácidos PLGLAG, y la sustitución de las proteínas fluorescentes cian y YFP el mejor nuevo par aceptor de donantes / rojo verde ( 46 ). Para lograr I y II,rebanadas agudas se prepararon y estimularon eléctricamente o optogenetically mientras que las imágenes del verde / rojo FRET indicador con microscopía confocal o de dos fotones.
La variación más elegante sería utilizar un reportero instantánea (ver más abajo) para conducir la expresión de un canal de rodopsina in vivo, y por lo tanto, la estimulación óptica en la rebanada debe recapitular la población de neuronas que habían estado activo durante un paradigma de aprendizaje. Para lograr iy iii, la fluorescencia se controla continuamente a través de una sonda de fibra óptica u objetivo stick implantado en la amígdala durante o justo después de un paradigma de formación, como el condicionamiento del miedo. Para lograr ii y iii, el animal moriría en un momento elegido durante o justo después del entrenamiento. Rodajas agudas se preparan a partir de la amígdala y la imagen con la microscopía confocal y de dos fotones con la esperanza de encontrar punctae sináptica con una alta proporción de verde / rojo indica escisión de la proteasa inducida y la pérdida de FRET. También se podría explorar si el grado de escisión indicador in vivo puede ser preservada durante la fijación del tejido para permitir la relación de imágenes de alta resolución en secciones delgadas. Intacto (alto FRET) y troceados (cero FRET) moléculas indicadoras deben conservar las propiedades durante la fijación.

Detectar agujeros recién cortado en el PNN con anticuerpos contra neoepítopos

Creo que puede haber una manera de activación de proteasas imagen y la erosión fresco de la PNN en un punto de tiempo dado sin tener que incorporar un reportero proteasa codificada genéticamente. Ataque endoproteasa crea dos fragmentos con un nuevo extremo amino-terminal y un nuevo extremo carboxilo terminal, que constituyen neoepítopos contra el que los anticuerpos específicos se puede levantar ( 47 ).Tales anticuerpos no reconocen la secuencia sin cortar en la proteína intacta. Fundamentalmente, los dos fragmentos tienen diferentes tiempos de retención ( Fig. S2. ): el de la izquierda que contiene el dominio G1 agregación es bien retenido dentro de la matriz, mientras que la derecha una que contiene no agregante se difunde más fácilmente G3 de distancia ( 47 ). Mi predicción es que la relación de etiquetado por los dos antineoepitope Abs debe proporcionar una idea aproximada de cuánto tiempo hace que la proteolisis se llevó a cabo. Antiguo erosiones deben manchar por sólo el neoepitope más largo conservado, mientras que los cortes frescos deben manchar tanto neoepítopos. La relación entre la edad y la relación de neoepitope podría ser calibrado según los estándares en el que la proteolisis generalizada se indujo a veces conocidos (por ejemplo, mediante la inyección de enzima activa o kainato) ( 21 ).

Prueba MMP-2/-9 Doble KO ratones para el déficit de comportamiento

Aunque los ratones genéticamente eliminan en MMP-2, MMP-9, o ambos han estado disponibles, las pruebas de comportamiento sorprendentemente poco se ha hecho en ellos. MMP-9 KO animales mostraron déficit en la potenciación a largo plazo de fase tardía del hipocampo (LTP) y dependiente del contexto condicionamiento del miedo (se cree que requieren tanto el hipocampo y la amígdala), pero no el tono con sensación de miedo condicionado (se cree que requerir la amígdala, pero no hipocampo) ( 20 ). A primera vista, este resultado podría argumentar que la MMP-9 es necesaria para la plasticidad del hipocampo, pero no la amígdala. Sin embargo, mi propia experiencia con estos animales en la investigación del cáncer es que MMP-2 y -9 tienen preferencias de sustrato muy similares y tienden a compensarse entre sí después de que uno se elimina, por lo tanto, la supresión de los dos es a menudo necesario para obtener el fenotipo completo ( 48 , 49 ). Por lo tanto, propongo que la repetición de las pruebas electrofisiológicas y de comportamiento asociado similares a las pruebas realizadas por Nagy et al. 20 ), sobre todo el tono-cued miedo acondicionado, con MMP-2/-9 animales KO doble.

Entregar más corto pulso de más inhibidor específico de proteasa e interferir con la inducción en Vivo

Varios grupos (revisado en ref. 16 ) han demostrado que los inhibidores de MMP de amplio espectro pueden prevenir LTP de fase tardía en diversas regiones del cerebro. Inyección intracerebroventricular de un inhibidor de este ha sido reportado para atenuar agua aprendizaje laberinto durante muchos días después de la inyección ( 50 ). Para hacer este experimento más incisivo y relevantes para el condicionamiento del miedo, me gustaría reemplazar el inhibidor de amplio espectro con un inhibidor de la más reciente, SB-3CT, que está disponible comercialmente y mucho más específico para MMP-2 y -9.Sorprendentemente, después de una única inyección ip, SB-3CT cruza rápidamente la barrera hemato-encefálica y luego hace desaparecer en pocos minutos ( 51 ). Esta ruta conveniente de administración y farmacocinética rápidos debe permitir delimitación más precisa del intervalo de tiempo, durante el cual se requiere un tiempo de actividad MMP-2/-9 durante la adquisición de recuerdos del miedo. Dicha resolución temporal debe permitir la supresión de una asociación aprendida sin interferir con las anteriores o posteriores acondicionado a diferentes contextos o estímulos. Tal evidencia reforzaría el caso de que la actividad proteasa es instructiva y codifica la información específica y que no es sólo a nivel mundial permisiva.

Aplicar Periodista Instantánea para marcar las células activadas durante la amígdala acondicionado Fear for High-Resolution Imaging, Optogenética manipulación o sobreexpresión de proteasas o inhibidores de la proteasa

A continuación, presento el concepto de los periodistas de instantáneas y centrarse en los métodos para la memorización instantánea de Ca 2 + en las neuronas activadas con la capacidad de detectar retrospectiva Ca 2 + cambios con alta resolución espacial y temporal. Periodistas instantáneas serían útiles en la neurobiología, incluso independiente de toda hipótesis neta perineuronal. Entre los muchos obstáculos a la asignación de la actividad cerebral son la enorme dificultad técnica de grabar simultáneamente desde miles a millones de neuronas identificadas a alta velocidad en 3D en una, comportándose preferiblemente organismo intacto y el problema de la identificación de las neuronas con el despido que es realmente importante para la comportamiento. La actividad de grabación puede, como mucho, dan correlaciones; estimulación específica, la inhibición y la ablación son necesarios para establecer la causalidad. Una solución parcial imperfecta a estos problemas es el uso de promotores de genes tempranos inmediatos, tales como c-fos, Arco, y zif268 ( 52 ). La inmunotinción para la expresión de dichos genes puede resaltar retrospectivamente neuronas activadas largo de grandes secciones de cerebro intacto sin necesidad de transparencia del tejido o la instrumentación sofisticada. Proteínas efectoras impulsados ​​por estos promotores pueden identificar las neuronas activadas para su posterior electrofisiología, ópticamente o farmacológicamente estimular o inhibir su cocción, o la ablación de ellos. Desafortunadamente, la relación entre la actividad neuronal y la inducción de estos genes tempranos inmediatos no está bien definido, y por lo tanto, la sensibilidad, la especificidad, y la resolución temporal de la respuesta son a menudo menos que ideal. Este poderoso concepto podría ser mejorado en gran medida por la ingeniería de un sistema indicador de instantánea (un super-fos, por así decirlo) para dirigir la expresión del reportero arbitraria y proteínas efectoras en respuesta a elevaciones definidas de [Ca 2 +] coincidiendo precisamente con un disparador externo, tales como la luz. La luz sólo necesitaría para propagar difusa en toda la región cerebral de interés sin necesidad de resolución de calidad de imagen.
Mi acercamiento a un sistema reportero instantánea debe ser construida mediante la fusión en tándem un dominio de unión de ADN, un Ca 2 +-triggered módulo de heterodimerización, un módulo de heterodimerización activados por luz, y un dominio de activación transcripcional ( figura. 3 ). Si (y sólo si) de altura [Ca 2 +] y la luz están presentes al mismo tiempo, las tres proteínas quiméricas se unen en una unidad de tres híbridos de activar la transcripción de cualquier reportero o gen efector adecuadamente colocada aguas abajo del sitio en el ADN para la proteína de unión a ADN. Los dominios de activación transcripcional y de unión de ADN tienen que ser potente pero con bajo fondo en células de mamífero, y por lo tanto, el más comúnmente utilizado Gal4-VP16 par debe ser adecuado ( 53  - 55 ). El módulo heterodimerización + activado por Ca2 será uno de los mutantes calmodulina M13 parejas que previamente hemos diseñado no una reacción cruzada con calmodulina endógena y que ofrecen una amplia gama de [Ca 2 +] afinidades ( 56 ). Tal bioorthogonality será esencial aquí, porque la calmodulina y M13 no se prefused uno con el otro, por lo tanto, la calmodulina exógena fusionada al dominio de unión de ADN no tendrá ninguna ventaja intramolecular sobre calmodulina libre endógena.
. Figura 3.
Historieta que representa una de las muchas maneras de diseñar una lectura transcripcional + activado por la luz y el Ca 2 para servir como reportero instantánea de la actividad neuronal. Muchos permutaciones diferentes de las tres fusiones son posibles, siempre que no solo de fusión contiene (Gal4 + VP16), (CaM + M13), o (PHYB + PIF6). PHYB, PIF6, y la luz roja se pueden sustituir por CRY2, CIBN y azul, respectivamente. Señales de localización nuclear pueden tener que ser proporcionada. Por simplicidad, la unión de la quimera Gal4 a su ADN afines se muestra sólo después del montaje final de la triple híbrido. IRES, sitio interno de entrada ribosomal.
Dos sistemas heterodimerización activados por luz se han publicado ( 55  - 57 ). Activación robusta luz del dominio 2/CRY2-binding cryptochrome flavina basado (CRY2/CIBN) ( 55 ) y el fitocromo phycocyanobilin basada B / fitocromo factor de interacción del sistema 6 (PIF6) ( 57 ) se ha informado, y ambos se ensayó mediante la capacidad de la luz para reclutar una proteína fluorescente fusionada a la membrana. Aunque el sistema de heterodimerización CRY2/CIBN luz azul sin duda suficiente para una prueba de principio, y muchas aplicaciones biológicas, un sistema fitocromo basada en última instancia, puede ser preferible, ya que debe ser activado por la luz roja más penetrante (650 nm) y se inhibe por IR cercano (750 nm). La disponibilidad de una longitud de onda de desconexión podría ser útil para afilar especificidad y resolución espacio-temporal. Idealmente, se podría diseñar y mejorar aún más el sistema fitocromo B/PIF6 para alterar el cromóforo del fitocromo B de phycocyanobilin exógena a endógena biliverdina y hacer la unión de luz disparado de los dos socios más sólidos. El gran tamaño del fitocromo B (908 aa codificada por nt 2724) también es incompatible con muchos vectores virales, que probablemente requiera el recorte de distancia de todos los dominios que no sean esenciales. Las mutaciones serían generadas por la intuición basado en la estructura, barajado de ADN ( 58 , 59 ), y la mutagénesis aleatoria (basado en la PCR o la hipermutación somática) ( 60 ). Cribado de alto rendimiento de los fenotipos se llevaría a cabo en células de mamífero en una versión simplificada del reportero instantánea, en la que el dominio de unión a ADN se fusiona directamente a los mutantes PHYB por lo que la transcripción sólo depende de heterodimerización dependiente de la luz independiente de Ca 2 +. El gen reportero sería β-lactamasa (bla), ya que es ideal para la selección tanto positiva como negativa por FACS ( 61   - 64 ). Uno podría manchar y clasificar para la expresión bla [fluorescencia azul-con cefalosporina-fluoresceína cumarina éster 2/acetoxymethyl sustrato (CCF2/AM) de células vivas] 1 hora o más después de la exposición a la luz roja y no la expresión bla (fluorescencia verde con CCF2 / h) después de IR cercano o ninguna luz.
Una variación interesante en el esquema anterior sería sustituir los dominios de activación transcripcional de unión y por fragmentos de ADN complementarios de la recombinasa Cre ( 55 , 65 ), por lo tanto, la coincidencia de alta [Ca 2 +] y la luz sería reconstituir funcional Cre y desencadenar la escisión de loxP-stop-loxP cassettes. La irreversibilidad de estos dos pasos, probablemente aumentar la sensibilidad en el costo potencial de un mayor fondo y especificidad temporal más pobres. Además, un reportero instantánea basado en Cre no puede estar dirigida a tipos específicos de células utilizando líneas conductor Cre.
Miedo acondicionado en la amígdala es una aplicación especialmente apropiado para un reportero instantánea debido a los resultados avanzados ya obtenidos con la expresión de c-fos-driven de los canales de la droga, o luz controlada ( 52 ). Por ejemplo, la mayor resolución temporal de un reportero de instantánea debe permitir delimitación más precisa de lo que los subconjuntos de neuronas se activan en qué momento los diferentes contextos o señales, porque la luz de activación se hizo coincidir con el (o seguir con una latencia definido) un estímulo o un tren de repeticiones para alcanzar en promedio de respuesta in situ. El reportero sería una proteína fluorescente para la reconstrucción post-mortem óptico o un generador de oxígeno singlete para la ultraestructura de microscopía electrónica ( 33 ). Optogenética o canales de drogas controladas excitatorios, bombas de hiperpolarización, la inhibición de la liberación sináptica optogenético ( 66 ), o la ablación de células con toxinas o generadores de oxígeno singlete ( 67 ) pondrían a prueba la suficiencia y la necesidad de las células activadas por la inducción y expresión de la plasticidad de comportamiento . La hipótesis específica de que la memoria del miedo se pueden codificar en el patrón de agujeros en la red Perineuronales podría ponerse a prueba mediante el uso de la reportero instantánea para mejorar la expresión de las proteasas secretadas, tales como la MMP-9, agrecanasa, hialuronidasa, condroitinasa o. Considerando que la aplicación deslocalizado de condroitinasa parece representar miedo recuerdos lábil ( 35 ), la sobreexpresión juiciosa de las proteasas de corte agujero en sólo esas neuronas activadas por un paradigma de condicionamiento específica deben fortalecer específicamente esa asociación. Un experimento complementario sería expresar inhibidores de la proteasa como el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1) ( 68 ), que debe bloquear la formación de memorias de sólo aquellas asociaciones cue-choque con el que se emparejó la luz de activación. Por último, el periodista instantánea podría ser capaz de conducir renovada expresión de los componentes PNN y por lo tanto, debilitar específicamente memorias preestablecidas que se está actualizando (de ahí que evoca la actividad neuronal y de alta [Ca 2 +]) en coincidencia con la luz de activación.

Utilice Tag plazos específicos para la medición era de proteínas para supervisar la síntesis de novo de las proteasas y componentes PNN

La síntesis de nuevas proteínas, síntesis de todo local en las sinapsis ( 69 , 70 ), es ampliamente reconocido como fundamental para la plasticidad. Recientemente hemos introducido una variable de tiempo específico para la medición de la edad de las proteínas (marca de tiempo) de etiquetas, que permite el etiquetado de medicamentos controlados de copias de nueva síntesis de proteínas específicas ( 71 ). Esta etiqueta se ha mejorado recientemente para incorporar un YFP división y la etiqueta miniSOG para la luz correlacionada y EM, lo que permite la fluorescencia en vivo y lecturas EM ( 72 ). Ningún otro método actualmente ofrece tal alta resolución espacio-temporal y la especificidad de las proteínas designadas genéticamente. Se han presentado pruebas de que MMP-9 se traduce a nivel local en synaptoneurosomes ( 18 ) y hasta reguladas por la estimulación glutamatérgica farmacológica bruto ( 18 , 21 ). Tales observaciones podrían mejorarse en gran medida mediante el uso de marca de tiempo ( 72 ) a la imagen naciente MMP-9 con mayor resolución espacio-temporal ( 72 ) en rebanadas agudas o el cerebro intacto como una función de la estimulación eléctrica o condicionamiento de la conducta, respectivamente. Tales experimentos proporcionarían una alternativa para asignar sitios de erosión PNN. También sería interesante para fusionar marca de tiempo a los constituyentes PNN para ver si y donde las proteínas son resintetizadas después de la disolución de las cadenas laterales de carbohidratos por condroitinasa inyectada o cuando la extinción de formación se lleva a cabo durante la ventana de reconsolidación ( 23 ). El último procedimiento parece para borrar el miedo en los adultos, mientras que la extinción ordinaria se superpone a un nuevo inhibidor de la memoria ( 23 ).

Conclusiones

He exagerar técnicas que mi laboratorio ha estado involucrado debido a la familiaridad personal y el deseo de poner de relieve su utilidad para una comunidad más amplia. Técnicas reales y experimentos serán elegidos por los científicos involucrados. Los experimentos se pueden basar en el mismo recinto parcial o totalmente equivocadas, en cuyo caso serán olvidados. Sin embargo, la importancia de la memoria a largo plazo es comparable con el significado de ADN. De 1943 a 1953, Avery et al. 73 ) y Watson y Crick ( 74 ) demostraron la importancia de ADN en llevar la información genética de generación en generación a través de la doble hélice. Sin embargo, el código genético era todavía desconocido. Watson y Crick ( 74 ) sólo trajo brillante visión sin nuevos datos experimentales. Franklin y Gosling ( 75 ) tenían el patrón clave de difracción de rayos-X. El presente trabajo tiene resultados experimentales frescas pero muchas predicciones. Tal vez dentro de unos años, al menos una profecía puede ser reivindicado.

Agradecimientos

El autor agradece a los Dres. Stephen Adams y Varda Lev-Ram para obtener ayuda con la preparación de manuscritos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvención NS27177.