martes, 28 de enero de 2014

Agonistas de molécula pequeña para el receptor de la tirotropina estimula la función tiroidea en tirocitos humanos y ratones

El siete receptores transmembrana (7TMRs) son objetivos importantes de la droga. Sin embargo, pequeñas moléculas ligandos para 7 transmembrana receptores para los que los ligandos naturales son grandes, las hormonas de glicoproteínas heterodiméricas, como la hormona estimulante de la tiroides (TSH, tirotropina), sólo recientemente se han reportado, y ninguno está aprobado para uso humano. Hemos utilizado la detección cuantitativa de alto rendimiento para identificar una molécula pequeña del receptor de la TSH (TSHR) agonista que se ha modificado para producir una segunda agonista con mayor potencia. Se demuestra que estos agonistas son altamente selectivos para TSHR humano frente a otros receptores de hormonas de glicoproteína e interactúan con el dominio de serpentina del receptor. Un bolsillo de unión en el dominio transmembrana fue definida por atracar en un modelo de homología TSHR y fue apoyado por mutagénesis dirigida al sitio. En cultivos primarios de tirocitos humanos, tanto de TSH y los agonistas aumentan los niveles de ARNm para tiroglobulina, tiroperoxidasa, cotransportador de yoduro de sodio, y deiodinasa tipo 2, y el tipo deiodinasa 2 actividad de la enzima. Por otra parte, la administración oral del agonista estimulada función de la tiroides en ratones, lo que resulta en un aumento de la tiroxina en suero y la absorción tiroidea con yodo radioactivo. Por lo tanto, hemos descubierto una pequeña molécula que activa TSHR humana in vitro, es activo por vía oral en ratones, y podría ser una ventaja para el desarrollo de medicamentos para utilizar en lugar de la TSH humana recombinante en pacientes con cáncer de tiroides.
Agonistas de molécula pequeña y antagonistas para 7-transmembrana receptores (7TMRs; receptores acoplados a proteínas G) representan aproximadamente el 40% de los fármacos en uso clínico ( 1 ). Los ligandos naturales para los 7TMRs para las que se han descubierto fármacos son ellos mismos, primordialmente, pequeñas moléculas, como la noradrenalina, la adenosina, y la acetilcolina. Ligandos de molécula pequeña para la subclase de 7TMRs para los que los ligandos naturales son 30-kDa glicoproteína hormonas heterodiméricas han comenzado recientemente a ser descrito, pero ninguna ha sido aprobada para su uso en seres humanos. Por ejemplo, los agonistas de molécula pequeña ( 2 - 5 ) y un antagonista (6 ) para la hormona luteinizante / receptor de gonadotropina coriónica (LHCGR), y agonistas de molécula pequeña ( 7 - 9 ) y antagonistas ( 10 - 12 ) para la FSH receptor (FSHR) han sido reportados. La tirotropina (hormona estimulante de la tiroides, TSH) receptor (TSHR) es el tercer miembro de la subfamilia de receptores de hormonas de glicoproteína. Recientemente hemos informado de los agonistas de molécula pequeña ( 13 ) y un antagonista ( 14 ) para el TSHR humano, sin embargo, los agonistas fueron de baja afinidad y se mostró a activar TSHRs sólo en un sistema de células de modelo en el que TSHRs humanos eran ectópica sobre-expresado.
El papel fisiológico de TSHRs en el eje hipotálamo-hipófisis-tiroides es bien conocida. TSH, que se produce en los tirotrofos de la glándula pituitaria anterior, se secreta en la circulación en respuesta a la estimulación de la hormona liberadora de TSH y, a su vez estimula la función de las células foliculares de tiroides (es decir, tirocitos) principales, en particular, a los aumentos en tamaño y número de los tirocitos, los aumentos en la captación de yoduro, y la biosíntesis y la secreción de las hormonas tiroideas. Sin embargo, TSHRs se sabe que se expresa en múltiples tejidos extratiroidea incluyendo el hueso, cerebro, riñón, testículos, y células del sistema inmune ( 15 ), pero el papel de TSHR en estos tejidos no está claro. Por ejemplo, se han propuesto posibles efectos de la activación de TSHR sobre el metabolismo óseo ( 16 , 17 ), pero se han reportado resultados contradictorios ( 18 , 19 ) y una conclusión definitiva no se ha establecido ( 15 ). Un agonista de molécula pequeña que se puede administrar por vía oral, se difunde fuera de la circulación sanguínea fácilmente, y se puede producir a bajo costo puede permitir cualquier efecto de la activación de TSHR sobre el hueso y los demás tejidos que expresan TSHRs a ser demostrado definitivamente.
TSH humana recombinante (rhTSH; Thyrogen) está actualmente prescrito principalmente como un complemento para el seguimiento de los pacientes que están tomando hormonas tiroideas después de someterse a una cirugía ablativa para el cáncer de la tiroides ( 20 ). rhTSH estimula la captación de yoduro y liberación de tiroglobulina (TG) de cualquier tipo de cáncer tiroideo residual y por lo tanto aumenta la sensibilidad de las mediciones de captación de yodo radioactivo o los niveles de TG en suero en estos pacientes. Sin embargo, rhTSH es difícil de producir, lo que conduce a su alto coste, y debe ser administrada mediante inyección. A TSHR agonista de molécula pequeña, valdría la pena, ya que podría producir los mismos efectos beneficiosos que rhTSH pero a un costo más bajo y con mayor facilidad de la administración oral, y por lo tanto puede estar disponible para su uso en una población de pacientes más grande.
En este reporte se describe un agonista TSHR de molécula pequeña que se puede utilizar como una sonda de la función TSHR en estudios en animales y podría servir como una ventaja para el desarrollo de fármacos que podrían ser utilizados en lugar de rhTSH en pacientes con cáncer de tiroides.

Resultados

La identificación de pequeñas moléculas agonistas TSHR por Cuantitativo en High Throughput Screening.

 
Utilizamos cribado de alto rendimiento cuantitativo (qHTS) para identificar agonistas TSHR. Este método de detección robusta permite un análisis en profundidad de los resultados del cribado primario y proporciona información detallada con respecto a potencia, eficacia, y las relaciones estructura-actividad ( 21 ). Se utilizó una línea celular que expresa a la vez un canal de nucleótidos cíclicos-dependientes de cationes ( 22 ) y TSHR ( 13 ). Los qHTS de TSHR optimizado y ensayos celulares nulos a través de una biblioteca de 73.180-compuesto se describen en otra parte ( 13 ).Análisis de los datos de la combinación de los qHTS / de pantalla contador de destino, junto con los datos de otros ensayos que miden las respuestas relacionadas con el campamento, se admiten para la selección de 96 potenciales agonistas TSHR de la pantalla primaria. Un ensayo de AMPc secundaria, que utiliza un anticuerpo de AMPc y la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo, elimina además compuestos de falsos positivos relacionados con la prueba. Cuarenta y nueve compuestos se confirmaron como verdaderos agonistas TSHR de moléculas pequeñas en estos experimentos de seguimiento.
Hemos seleccionado los 8 compuestos más potentes con una EC 50 rango 0,6 a 12 M y de nuevo a prueba estos para la eficacia y la selectividad. Compuesto 1 ( . Fig. 1 Una ) fue elegido para un estudio más ya que es un agonista completo en TSHR por comparación con una concentración máximamente efectiva de la TSH (100% de eficacia). Compuesto 1 activa la acumulación de AMPc mediada por TSHR con un EC 50 de 660 nM. Además, de los 8 compuestos más potentes de los qHTS, compuesto 1 fue el más selectivo para TSHR, sin actividad agonista detectable en el LHCGR estrechamente relacionadas o FSHR ( . Fig. 1 B ).
La figura. 1.
Estructuras, selectividad, y las potencias de los compuestos 1 , 2 , y 3 . A ) Estructura química del compuesto 1 : [NCGC00168126-01]. Estructura química del compuesto 2 : [NCGC00161870-01]. Estructura química del compuesto 3 : 3 - (furan-2-ilmetil) -2 - (4-metoxi-3-(fenoximetil) fenil) -2,3-dihidroquinazolin-4 (1 H)-ona [NCGC00165237-01]. B ) Las células que expresan de forma estable TSHRs, LHCGRs, o FSHRs fueron expuestos a las concentraciones indicadas de los compuestos 1 y 2 o a una concentración máxima eficacia del ligando cognado, TSH (540 nM), LH (34 nM), o FSH (34 nM), respectivamente, en presencia de 1 mM de isobutilmetilxantina como se describe en Materiales y Métodos . Después de 60 min, las células se lisaron y los niveles de cAMP se midieron por ELISA. Los datos de 3 experimentos independientes con muestras duplicadas se muestran como el porcentaje de la estimulación por la hormona afín.
En un intento de mejorar la potencia del agonista de molécula pequeña, más de 100 análogos del compuesto 1 se sintetizaron y se ensayaron con bioensayo AYUDA 1401 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi? aid = 1401 y loc = ea_ras ). . Fig. Una muestra las estructuras de compuesto 1 , el análogo más potente, compuesto 2 , y un análogo inactivo, compuesto 3 .Compuesto 2 es un agonista completo en TSHR con un EC 50 de 40 nM ( . Fig. 1 B ) y, como compuesto 1 , que no tiene ninguna actividad en FSHR o LHCGR (datos no mostrados). Los compuestos 1 y 2 contienen un aminal, un grupo funcional que está sujeta a la hidrólisis y / o otros mecanismos de degradación. Para ello hemos realizado un estudio de estabilidad hidrolítica de estos reactivos en neutro, ácido (pH ≈ 2), y (pH ≈ 12) condiciones acuosas básicas. Compuesto 2 era sorprendentemente estable en condiciones neutras y básicas (t 1/2 de ≈ 16 h), pero se encontró a degradarse a pH bajo (t 1/2 de ≈ 3 h).

El compuesto 2 se une a la transmembrana helicoidal paquete de TSHR.

 
En base a los estudios previos de 2 ligandos de moléculas pequeñas de TSHR, un agonista parcial Org41841 ( 23 ) y un antagonista ( 14 ), predijo que el compuesto 2 se uniría a la región de la serpentina de TSHR. Para mostrar que el compuesto 2 se une al dominio de serpentina, hemos probado la activación de un mutante de TSHR en la que se ha eliminado la unión de la gran ectodominio amino-terminal responsable de la TSH.Este TSHR truncada (KFLR) se demostró por Vlaeminck-Guillem y col. 24 ) no para unirse o ser activado por la TSH. Compuesto 2 mostró una eficacia del 12% más bajo y menor potencia (CE 50 de 1,7 M) en KFLR de TSHR ( . Fig. 2 A). El hallazgo de que el compuesto 2 activa un receptor de TSHR truncada sin todo el ectodominio amino-terminal proporciona evidencia experimental de que este agonista de molécula pequeña se une a la región de serpentina de TSHR.
La figura. 2.
Compuesto 2 de TSHR activa mediante la unión a la transmembrana helicoidal paquete. A ) Los efectos del compuesto 2 o TSH en la acumulación de cAMP en células que expresan TSHR, TSHR-KFLR en el que la gran ectodominio amino-terminal, al que se une la TSH, se suprime o N5.47A, en el que Asn en la posición 5,47 fue mutado a Ala Los datos de 2 experimentos independientes con muestras duplicadas se muestran como el porcentaje de la estimulación de la acumulación de cAMP estimulada por la TSH o compuesto 2 . B ) de acoplamiento del compuesto 2 en el modelo de homología de TSHR predice que el compuesto 2 se une dentro de la transmembrana helicoidal paquete ( Izquierda ). Ampliación de la región en caja a la izquierda ( derecha ) muestra una interacción del compuesto 2 con un Asn en TMH5 (N5.47).
Se utilizó un modelo de homología de la región de serpentina de TSHR basado en la opsina, la primera plantilla estructural de una proteína G-receptor acoplado activado ( 25 ). Experimentos de acoplamiento predijeron que el compuesto 2 se une a la misma cavidad en la transmembrana helicoidal paquete de TSHR como se informó anteriormente para un agonista de molécula pequeña parcial, Org41841, y un antagonista ( 14 , 23 ), pero el compuesto 2 parece tener diferentes sitios de interacción ( Fig.. 2 B ). En particular, el modelo predice que el compuesto 2 forma un enlace de hidrógeno con un residuo Asn en TMH5 [N5.47 en la nomenclatura Ballesteros y Weinstein ( 26 ); la figura. B ]. Para probar la hipótesis de que es necesaria para la activación de TSHR por el compuesto de una interacción con N5.47 2 , se construyó un mutante específica de sitio de TSHR en el que N5.47 fue sustituido por Ala (N5.47A). La expresión en la superficie celular de N5.74A es 18% en comparación con TSHR, pero este mutante es activado por la TSH con una potencia y una eficacia similar a la de TSHR ( . Fig. 2 Una ). En contraste, el compuesto 2 tiene casi ninguna actividad en N5.47A; compuesto 1 es inactivo en N5.47A también (datos no mostrados). Estos datos apoyan la conclusión de que el compuesto 2 se une en un bolsillo dentro de la transmembrana helicoidal paquete de TSHR.

El compuesto 2-Estimula la tiroides específicos de expresión de genes en cultivos primarios de tirocitos Humanos.

 
Debido a que hemos identificado estos agonistas utilizando un sistema de pila de modelo, las células HEK293 establemente sobre-expresión de TSHR, nos trataron de confirmar sus actividades en un sistema de células fisiológicamente más relevantes. Utilizamos tirocitos humanos derivados de 2 donantes en cultivos primarios. Como TSH aumenta específicamente la expresión de varios genes en tirocitos ( 27 ), hemos probado los efectos del compuesto 2 en la expresión del ARNm de TG, tiroperoxidasa (TPO), cotransportador de sodio-yoduro (NIS) y deiodinase tipo 2 (ESD2;Fig. . 3 Una ). Después de 24 h, el tratamiento de tirocitos con el compuesto 2 se incrementaron TG, TPO, NIS y ESD2 mRNAs. Compuesto 2 aumentó TG mRNA con la mayor eficacia y el aumento de TSH ARNm para TPO, NIS y ESD2 algo menos eficaz que la TSH. También midieron los efectos del compuesto 2 en ESD2 ensayando su actividad enzimática para de-yodar T4 a triyodotironina ( 28 ). Tanto TSH y el compuesto 2 aumentaron la actividad de proteínas ESD2 ( . Figura 3 B ).
La figura. 3.
La estimulación de la expresión de los ARNm para TG, TPO, NIS, y ESD2, y la proteína ESD2 por la TSH o compuesto 2 en cultivos primarios de tirocitos humanos. (A ) tirocitos se incubaron en medio que contenía FBS al 2% y TSH (18 nM) o el compuesto 2 (30 mM) como se describe en Materiales y Métodos . Después de 24 h, las células se lisaron y se midieron y se normalizó a GAPDH mRNA de los niveles de los ARNm. Los niveles de mRNA se presentan como la estimulación veces sobre el control. Se muestran los datos de los 3 experimentos independientes con muestras duplicadas. B ) La actividad enzimática ESD2 se presenta como tasas de desyodación tiroxina. Se muestran los datos de los 3 experimentos independientes con muestras duplicadas.
Estos resultados muestran que el compuesto 2 es un agonista eficaz con actividades similares a la TSH en cultivos primarios de tirocitos humanos que expresan TSHR a niveles fisiológicos.

Compuesto 2 estimula la función de la tiroides de la glándula en ratones después de la administración ip y por esofágica Gavage.

 
Para demostrar que estos agonistas de moléculas pequeñas podrían ser clientes potenciales para el desarrollo de fármacos clínicamente útiles, era necesario demostrar que son eficaces en modelos animales. Antes de la realización de estudios en ratones, se mostró que el compuesto 2 tenía potencias y eficacias similares en células HEK que sobreexpresan TSHRs humanos o de ratón (datos no mostrados). Luego estudió los efectos del compuesto 2 en función de la glándula tiroides en ratones. Para comparar los efectos del compuesto 2 en comparación con los de TSH, que primero administró compuesto 2 y TSH por inyección ip ( . Fig. 4 A ).Compuesto 2 aumentó de T4 en suero a un nivel que no fue estadísticamente diferente de la TSH con aumento, mientras que el compuesto inactivo 3 no afectó de T4 en suero.
La figura. 4.
La estimulación por el compuesto 2 de la tiroxina (T4) la secreción y la absorción tiroidea con yodo radioactivo en ratones. A ) Los ratones recibieron vehículo (PEG300, de control), la TSH (32 g), compuesto 2 (0,5 mg), o el compuesto análogo inactivo 3 (0,5 mg) por inyección ip.Se extrajo sangre 2 h más tarde y T4 se midió en el suero. Los datos de 2 experimentos independientes con 3 ratones se muestran cada uno. B ) Vehículo (control) o compuesto 2 (2,5 mg) se administró por sonda esofágica y T4 en suero se midió 2 h más tarde. Los datos de 4 experimentos independientes con 3 ratones se muestran cada uno. C ) Vehículo (control) o compuesto 2 (2,5 mg) se administró por sonda esofágica en los días 1 y 2. En el día 3, Na 125 I (20 Ci) se administró por sonda esofágica y los ratones se sacrificaron 2 h más tarde. Las glándulas tiroides y pequeños trozos de hígado fueron extirpados y se cuentan por 125 I radiactividad. Los datos se presentan como la relación de radiactividad en la tiroides / hígado. Los datos de 2 experimentos independientes con 2 y 4 se muestran los ratones cada uno.
Para el compuesto 2 para servir como un fármaco, sería ventajoso si era activo después de la administración oral. Para simular la administración oral, se administró el compuesto 2 a ratones mediante alimentación por sonda esofágica y puso de manifiesto que, a través de esta ruta, el compuesto 2 se eleva de T4 en suero ( . Fig. 4 B ) y, quizás más importante si fuera para ser utilizado como un medicamento plomo, estimulado la captación de radioyodo por la glándula tiroides de ratón ( . Fig. 4 C ). Estos datos muestran que el compuesto 2 estimula la función de las células de la tiroides en ratones después de la absorción desde el tracto gastrointestinal.

Discusión

Este estudio se realizó para identificar agonistas de molécula pequeña para TSHR que están activos en tirocitos humanos y en modelos animales con los objetivos a largo plazo de desarrollo ( i ) sondas útiles para estudiar la función fisiológica (s) de TSHR en tejidos extratiroidea y ( ii ) fármacos que podrían ser utilizados como complementos para diagnosticar un tumor residual o recurrente en pacientes después de la cirugía para el cáncer de tiroides. Logramos estos objetivos mediante la extensión de nuestro análisis de los compuestos activos encontrados por qHTS de moléculas similares a las drogas ( 21 ).
Como qHTS produjeron varias clases de moléculas pequeñas que mostraron activación de TSHR ( 13 ), los 8 compuestos más potentes se eligieron para su posterior análisis con TSHR y se comparan con la LHCGR y FSHR estrechamente relacionados. Estos experimentos identificaron compuesto 1 como el principal compuesto más prometedor. Modificación química adicional de compuesto 1 condujo a la identificación de compuesto 2 , un análogo con 16 veces la potencia mejorado. Hemos encontrado que los compuestos 1 y 2tienen selectividades y eficacias para TSHR comparables a la de la TSH en un sistema de células de modelo de sobre-expresión de TSHRs. A continuación, prueba compuesto 2 en más fisiológicamente relevantes tirocitos humanos, que expresan endógenamente TSHRs y expresan los genes específicos-tiroides TG, que es el precursor de las hormonas tiroideas, y TPO, que se acopla a yoduro de tirosilo de la tiroglobulina ( 29 ). También se midió el efecto de estos agonistas sobre los niveles de otros 2 genes importantes en función de la glándula tiroides: NIS, que es el transportista que media acumulación yoduro (30 ), y ESD2, que convierte T4 a triyodotironina ( 28 ). El agonista de molécula pequeña aumentó los niveles de ARNm para TG, TPO, NIS, y ESD2, lo que demuestra la actividad del compuesto 2 en un objetivo humano natural de la acción de TSH. El aumento de la actividad de la enzima de ESD2 en los tirocitos después del tratamiento con el compuesto 2 sugirió que los niveles de proteína DIØ2 se incrementaron también. Por otra parte, hemos demostrado que el compuesto 2 podría estimular la función de la glándula tiroides (aumento de la secreción de T4 y la captación de yodo tiroideo) en ratones después de la administración por sonda esofágica y la absorción en el tracto gastrointestinal, que apoya aún más su potencial como una sonda fisiológica y su uso en pacientes .
Se utilizó 2 enfoques para mostrar que el compuesto 2 se une al dominio de serpentina de TSHR en contraste con el ligando natural de TSH, que se une principalmente a la gran ectodominio N-terminal ( 31 ).Se utilizó un mutante TSHR que no contiene el ectodominio N-terminal y que se había demostrado no ser activado por TSH ( 24 ) y puso de manifiesto que fue activado por el compuesto 2 . También se utilizó un modelo de homología 3D de TSHR ( 14 , 23 ), que se basa en la estructura cristalográfica de rayos X de la opsina ( 25 ), para predecir el bolsillo de unión para el agonista de molécula pequeña y predecir los residuos de aminoácidos dentro de la bolsillo que interactúan con el compuesto 2 . Mediante el uso de una mutación específica de sitio dentro de la bolsa putativo vinculante TSHR, proporcionamos evidencia que apoya un sitio haz transmembrana para la unión del compuesto 2 . Nosotros predijimos y proporcionamos soporte experimental para un bolsillo de unión transmembrana similar para el antagonista TSHR pequeña molécula que se informó recientemente ( 14 ).
La más prominente potencial uso clínico de una pequeña molécula de TSHR-agonista es en una prueba de diagnóstico para la metástasis y la recurrencia de cáncer de tiroides. Pruebas existentes se basan en rhTSH para estimular 131 I captación en los pacientes con cáncer diferenciado de tiroides ( 20 ). Sin embargo, la unión a TSHR hTSH es una interacción de afinidad moderada y, por lo tanto, requiere altas dosis de la TSH recombinante que deben administrarse por vía parenteral para ser eficaz ( 32 ). Además, el procedimiento es sumamente costosos debido al alto coste de producción de proteínas recombinantes. Por lo tanto, el desarrollo de agonistas de molécula pequeña ofrecen ventajas de la producción de bajo costo, la administración oral, y el potencial de aumento de la actividad en comparación con la TSH recombinante (33 , 34 ).
Por último, nuestros resultados proporcionan la prueba de principio para la efectividad de los agonistas de molécula pequeña para TSHR en las células humanas y murinas que expresan TSHRs endógenamente.Estos resultados apoyan el uso potencial del compuesto 2 como una sonda de la función de TSHR en los tejidos distintos de la glándula tiroides que expresan TSHRs en modelos animales y quizás en pacientes.Aunque la eficacia completa y alta selectividad de los nuevos agonistas descritos aquí son prometedores, la optimización química de estos nuevos andamios soportados por modelado molecular se realizó en un esfuerzo para mejorar aún más sus potencias y potencial terapéutico. Se prevé que un enfoque complementario usando modificaciones racionales de estos nuevos agonistas de molécula pequeña producirá moléculas más potentes para las pruebas en modelos animales y para el futuro desarrollo clínico.

Materiales y Métodos

qHTS.

 
Los qHTS se realizó contra una biblioteca de compuestos 73180-miembro usando un ensayo cíclico de nucleótidos-gated canal acoplados a AMPc (BD Biosciences). La línea celular parental HEK293H-CNG y la línea celular estable expresando TSHR se compraron de BD Biosciences. Los compuestos se diluyeron en serie para medir la activación del receptor dependiente de la dosis usando un sistema de cribado robótico totalmente automatizado (Kalypsys). Una descripción detallada de nuestro protocolo qHTS Recientemente se ha descrito en otra parte ( 13 ).

Síntesis de los compuestos 1, 2, y 3.

 
Las estructuras químicas de los compuestos 1(NCGC00168126-01), el compuesto 2 (NCGC00161870-01), y el compuesto 3 (NCGC00165237-01) se ilustran en la fig. Una . Los esquemas sintéticos químicos se presentan en el Apéndice SI .

Cultivo celular, transfección transitoria, y generación de líneas celulares estables que expresan TSHR, LHCGR, o FSHR.

 
Las células HEK-EM 293 se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, y 10 mg / ml de estreptomicina (Life Technologies) a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora. Las células fueron transfectadas transitoriamente con el WT TSHR y receptor mutante en placas de 24 pocillos (7,5 × 10 4 células por pocillo) con 0,2 g de ADN / pocillo utilizando reactivo Fugene 6 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La generación de líneas celulares estables que expresan TSHR, LHCGR, o FSHR se describe en otro lugar ( 14 ).

Site-Directed Mutagénesis de TSHR.

 
El mutante N5.47A se introdujo en hTSHR-pcDNA3.1 mediante el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange XL (Stratagene). La construcción se verificó por secuenciación (MWG Biotech).

Determinación de cAMP intracelular Acumulación.

 
Las células HEK-EM293 transfectadas transitoriamente o establemente células que expresan TSHR, LHCGR, o FSHR fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 50.000 células / pocillo en DMEM que contenía 10% de FBS. Las células se cultivaron durante 24 h antes de la incubación durante 1 h en DMEM sin ​​suero que contenía 1 mM 3-isobutil-1-metilxantina (Sigma) y TSH, LH, FSH, o pequeñas moléculas ligandos en un humidificado 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. Después de la aspiración de los medios de comunicación, las células se lisaron usando tampón de lisis del sistema directo de cAMP pantalla (Applied Biosystems). El contenido de cAMP del lisado celular se determinó utilizando el método descrito en el protocolo del fabricante. Las potencias (es decir, la CE 50 ) de los ligandos se obtuvieron a partir de curvas de dosis-respuesta mediante el análisis de datos con el software GraphPad Prism 4 para Windows.

Determinación de la Superficie Celular de TSHR Expresión.

 
Después de la transfección, las células se cultivaron durante 48 h, cosechadas usando 1 mM de EDTA mM de EGTA / 1 en solución de PBS, y se transfirieron a tubos Falcon 2058. Las células se lavaron una vez con solución de PBS que contiene 0,1% de BSA y 0,1% NaN 3 (tampón de unión), se incubaron durante 1 h con una dilución 1:200 de anticuerpo de ratón de TSHR anti-humano (Serotec) en tampón de unión, se lavaron dos veces, y se incubaron durante 1 h en la oscuridad con una dilución 1:200 de un Alexa Fluor F 488 marcado con (ab ') 2fragmento de cabra anti-ratón IgG (Molecular Probes) en tampón de unión. Antes del análisis de FACS (FACSCalibur; BD Biosciences), las células se lavaron dos veces y se fijaron con paraformaldehído al 1%.La expresión del receptor se estima por la intensidad de fluorescencia y la eficacia de transfección se estimó a partir del porcentaje de células fluorescentes.

Modelado molecular y estudios de acoplamiento.

 
El modelo de homología de la región de la serpentina del TSHR humano se generó con Sybyl 8,0 software (Tripos). En nuestros estudios anteriores sobre un antagonista de bajo peso molecular para el TSHR ( 14 ), la plantilla estructural se basa en la estructura de rayos x del receptor β2-adrenérgico que contiene un agonista inverso ( 35 , 36 ). Los valores rmsd bajas reportadas entre ejes vertebradores de las hélices transmembrana (TMHS) de las estructuras que se utilizan y las estructuras de rayos X previamente resueltos de la rodopsina bovina ( 37 - 39 ) y del receptor de adenosina ( 40 ) apoyan la fiabilidad del modelo TSHR anterior. Todas estas plantillas contienen un agonista inverso que se estabiliza una conformación inactiva del receptor.
Por el contrario, para nuestros estudios de acoplamiento de TSHR agonista en el presente estudio, se utilizó la estructura de rayos X recientemente resuelto de opsina ( 25 ) como plantilla estructural de un modelo TSHR porque esta estructura presenta características probables de una conformación 7TMR activo.En este nuevo modelo, se hicieron varias correcciones-TSHR específica, como extensiones de hélice regulares en TMH2 y TMH5 de TSHR lugar de protuberancias estructurales en las 2 hélices de opsina, que son causadas específicamente por cadenas laterales que no están presentes en TSHR. Loops fueron refinados por mejor ajuste y la homología con fragmentos de otras proteínas de Protein Data Bank. Las lagunas de que faltan los residuos en los bucles de la estructura de la plantilla se cerraron por la herramienta de bucle Búsqueda implementado en el software Sybyl 8.0 (Tripos). Minimización de gradiente conjugado se realizaron hasta que convergen en un gradiente de extinción de 0,05 kcal / (mol * Å) utilizando el "campo de fuerza" en el ámbar de la versión 7.0 del software (Universidad de California, San Francisco).Calidad y estabilidad del modelo fueron validados por el control de la geometría por PROCHECK ( 41 ).Para el reconocimiento del sitio de unión al ligando, varias herramientas del paquete Tripos, tales como identificador de sitio y manual y acoplamiento automático (Dock, flexs, FlexX), se aplicaron. La designación de los aminoácidos en el dominio de transmembrana se basa en la nomenclatura Ballesteros y Weinstein (26 ). Imágenes gráficas moleculares se producen utilizando el paquete Quimera Del Recurso de Biocomputación, Visualización e Informática de la Universidad de California, San Francisco.

Cultura de Primaria tirocitos Humanos.

 
Muestras de tejido de la tiroides se obtuvieron de tejido tiroideo normal a partir de los pacientes sometidos a tiroidectomía total para el cáncer de tiroides en los Institutos Nacionales de Salud El Centro Clínico. Los pacientes dieron su consentimiento informado en un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional y se recibieron los materiales de forma anónima a través de la aprobación de la actividad de investigación a través de la Oficina de Sujetos Humanos de Investigación. Los especímenes se mantuvieron en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) en hielo, y el aislamiento de las células se inició dentro de las 4 h después de la cirugía. Todas las manipulaciones se realizaron bajo condiciones estériles. Las muestras de tejido se picaron en trozos pequeños por pinzas quirúrgicas finas y tijeras en un plato de 10 cm con un pequeño volumen de HBSS. Las piezas de tejido se transfirieron a un tubo de 15 ml (Falcon) y se lavan al menos 3 veces con HBSS. Después, las piezas de tejido se incubaron con HBSS que contenía 3 mg / ml de colagenasa tipo IV (Gibco). La digestión enzimática procedió durante 30 minutos o más con agitación constante en un baño de agua a 37 ° C hasta que se obtuvo una suspensión de células aisladas. Después de centrifugación durante 5 min a 150 × g se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 ml de DMEM con 10% de FBS. Las células se sembraron en 10 cm de platos de cultivo de tejidos y se incubaron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2incubadora. Después de 24 h, se eliminó el sobrenadante que contiene las células no adherentes. Los cultivos primarios de células de la tiroides formaron una monocapa confluente en 5-7 d. Para la determinación de TG, TPO, NIS, o ESD2 la expresión del ARNm, tirocitos se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 0,6 × 10 4 células / pocillo 24 h antes del experimento. Para la determinación de la actividad enzimática ESD2, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 × 10 5 células / pocillo 24 h antes del experimento.

RT-PCR cuantitativa.

 
El ARN total se purificó usando kits RNeasy Micro (Qiagen). Primera línea de cDNA fue preparado usando una alta capacidad de cDNA Archivo Kit (Applied Biosystems). RT-PCR se realizó en reacciones de 25-mu l utilizando cDNA preparadas a partir de 100 ng o menos de ARN total y Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Primers y sondas fueron Ensayo-on-Demand (Applied Biosystems). Los resultados cuantitativos de RT-PCR se normalizaron a GAPDH para corregir las diferencias en la entrada de ARN.

Ensayo deiodinase.

 
125 I-tiroxina (116 Ci / mmol; Perkin-Elmer) se purificó utilizando LH-20 columnas (Amersham Pharmacia) antes de cada experimento. Las células se homogeneizaron en 0,25 M de sacarosa, 0,02 M de Tris / HCl (pH 7,0), y EDTA 1 mM. Después de centrifugación a 1000 × g , el sobrenadante se recogió y se almacenó a -80 C. Actividad De-iodinase se midió de acuerdo con los métodos descritos previamente ( 42 , 43 ). Cada reacción se lleva a cabo en presencia de propiltiouracilo 5 mM (Sigma), un inhibidor de la iodinase-de tipo 1. Después de contar la radiactividad total con una γ-counter, el 125 Liberé se separó por cromatografía de intercambio iónico en columnas AG50W-X8 (Bio-Rad), y el efluente se midió en un contador γ-. Cada punto de datos se midió por triplicado; datos se expresaron como la velocidad de desyodación (femtomoles por minuto por miligramo de proteína) después de la corrección para la desyodación no específica.

Función tiroidea en ratones.

 
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el cuidado de los animales y el uso comité institucional en el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los Institutos Nacionales de Salud. Mujeres C57BL / 6 ratones (Jackson Laboratory) se mantuvieron con una dieta estándar (NIH-07; Zeigler Brothers). El agua y los alimentos estaban disponibles ad libitum. La edad osciló entre 9 y 18 semanas, y la media de peso fue de 25 g.
Se han comparado los efectos del compuesto 2 y TSH en suero de T4 en ratones. En la primera serie de experimentos, se administran los compuestos por inyección ip a los ratones no anestesiados. Se administró de TSH (32 mg en 0,2 ml de solución salina), compuesto 2 (500 g), o el compuesto análogo inactivo 3 (500 mg) en 50 l de PEG300 (vehículo). El suero se obtuvo de terminales hemorragias retro-orbital de los ratones anestesiados 2 h después de la inyección. Los niveles totales de T4 se midieron con el GammaCoat libre T4 RIA (Diasorin) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para determinar si el Compuesto 2 sería eficaz cuando se administra por vía oral, se administró el compuesto 2 (2,5 mg) en 150 l de PEG300 por sonda esofágica; TSH no podría ser utilizado como un control positivo, ya que no se absorbe intacta en el tracto gastrointestinal . Se midió el suero de T4 2 h después de la administración por sonda nasogástrica por la recogida de 60 l de sangre de la vena de la cola; el control era PEG300 solo.
Debido a que el uso clínico actual de rhTSH es para estimular la captación de radioyodo por el tejido tiroideo residual / canceroso, se midió el efecto del compuesto 2 en 125 que la captación por las glándulas tiroideas de los ratones después de la administración del compuesto 2 por sonda esofágica en un protocolo similar al utilizado en pacientes ( 44 ). Se administró el compuesto 2 (2,5 mg en 150 l) o solo PEG300 a ratones en los días 1 y 2, y luego administramos Na 125 I (20 Ci en 300 l de HBSS) a través de sonda esofágica en 3 d. Dos horas después de la administración de Na 125 I, los ratones fueron sacrificados y sus glándulas tiroideas fueron extirpados, como eran pequeños trozos de hígado. Los tejidos se pesaron y el125 se contó la radiactividad I en cada tejido. Los datos se analizaron como la relación de 125 radiactividad I en la tiroides a 125 Me radiactividad en el hígado.

Análisis estadístico.

 
Los datos se expresan como media ± SE. Los datos fueron analizados por Student t prueba o un modelo lineal, P <0,05 fue considerado significativo.

Agradecimientos

Damos las gracias a Valentina Congedo para proporcionar el tejido tiroideo humano, Gilbert Vassart y Sabine Costagliola para proporcionar el constructo KFLR, y William Jou de asistencia técnica con los experimentos en ratones. Damos las gracias a Bill Leister y Jeremy Smith para el apoyo analítico y Paul Shin para apoyar la gestión compuesto. Esta investigación fue financiada por los Programas de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y del Riñón y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, y la iniciativa de las bibliotecas moleculares de los Institutos Nacionales de la Salud Plan de trabajo para la Investigación Médica, de los Institutos Nacionales de Salud.Molecular producción de imagen gráfica por el paquete Chimera (Recursos para Biocomputación, Visualización e Informática de la Universidad de California, San Francisco) fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud Grant P41 RR-01081.

Notas al pie

  • 1 ¿A quién debe dirigirse la correspondencia. E-mail: marving@intra.niddk.nih.gov
  • Editado por Robert J. Lefkowitz, Duke University Medical Center, Durham, NC, y aprobó 03 de junio 2009
  • Contribuciones de los autores: SN, G. Krause, AC, CA, CJT, y MCG de investigación diseñado; SN, WH, ST, G. Krause, G. Kleinau, ATA, WZ, y OG realizado investigación; SN, G. Krause, NTS , FSC, CJT, BMR y MCG analizaron los datos, y SN, BMR y MCG escribió el documento.
  • Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
  • Este artículo es una presentación directa PNAS.
  • Este artículo contiene información de soporte en línea en www.pnas.org/cgi/content/full/0904506106/DCSupplemental.
  • Disponible gratuitamente en Internet a través de la opción de acceso abierto PNAS.