martes, 14 de enero de 2014

microRNA-132 regula el crecimiento dendrítico y la arborización de las neuronas recién nacidas en el hipocampo adulto

Las neuronas recién nacidas en el giro dentado del hipocampo adulto dependen de la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB) de señalización para su diferenciación en células granulares maduras y su integración en la red dentada. Entre sus muchos objetivos, el factor de transcripción CREB activa la expresión de un locus del gen que produce dos microARN, miR-132 y miR-212. En las neuronas corticales y del hipocampo en cultivo, miR-132 funciones aguas abajo de CREB para mediar el crecimiento dendrítico dependiente de la actividad y la formación de la columna vertebral en respuesta a una variedad de vías de señalización. Para investigar si miR-132 y / o de miR-212 contribuyen a la maduración de las dendritas en las neuronas recién nacidas en el hipocampo adulto, insertamos sitios LoxP que rodean el locus miR-212/132 y destinados específicamente su supresión por estereotácticamente la inyección de un retrovirus que expresa Cre recombinasa. La deleción del locus miR-212/132 causó una disminución dramática en la longitud de las dendritas, la arborización, y densidad de la espina. El locus miR-212/132 puede expresar hasta cuatro microRNAs distintas, miR-132 y -212, y su inverso hebras de miR-132 * y * -212. El uso de sensores radiométricos microARN, se determinó que el miR-132 es el producto predominante activa en las neuronas del hipocampo. Llegamos a la conclusión que el miR-132 se requiere para la maduración normal de las dendritas en las neuronas recién nacidos en el hipocampo adulto y sugieren que este microARN también puede participar en otros ejemplos de la señalización mediada por CREB.
El giro dentado del hipocampo apoya la neurogénesis durante toda la vida, y las neuronas recién nacidas se generan en este sitio forman sinapsis funcionales, se integran en la red dentado, y contribuir al aprendizaje espacial compleja ( 1 , 2 ). Neurogénesis del hipocampo adulto es estimulada por el aprendizaje espacial, el ejercicio físico y el tratamiento con fármacos antidepresivos ( 3 - 5 ). Por el contrario, el envejecimiento, el estrés psicosocial, y los glucocorticoides adrenales exceso están vinculados a la disminución de este tipo de la neurogénesis ( 6 - 8 ). Curiosamente, estas disminuciones pueden ser reversibles, y muchos de los estímulos que promueven la neurogénesis para promover el crecimiento dendrítico y un aumento de la complejidad del eje ( 9 ). Esta respuesta sugiere que estas neuronas recién nacidos tienen un alto grado de plasticidad que está fuertemente influenciada por los estímulos externos.
Un mecanismo potencial subyacente en la plasticidad dendríticas de las neuronas del hipocampo recién nacidos implica el elemento de respuesta de cAMP proteína factor de transcripción (CREB), que media las señales de una variedad de cascadas de transducción de señales de unión. Varios estudios han demostrado que el bloqueo de CREB conduce a una disminución dramática en la neurogénesis en el hipocampo y la arborización dendrítica en las neuronas recién nacidos ( 10 , 11 ), aunque los resultados dispares También se ha informado ( 12 ). Debido a CREB puede activar miles de genes, es difícil asociar objetivos específicos con funciones CREB particulares. En un esfuerzo por caracterizar estos objetivos, hemos desarrollado un método denominado "Análisis de serie de la cromatina de ocupación" para identificar los sitios de unión a CREB a nivel de todo el genoma ( 13 ). Muchos RNAs no codificantes, incluyendo uno que codifica dos microARN, miR-212 y miR-132, fueron algunos de los objetivos de CREB. Introducción de miR-132 en neuronas corticales primarias estimuló el crecimiento de neuritas robusto, mientras que la inhibición de miR-132 embotado el crecimiento de neuritas en condiciones basales y bloqueó la respuesta a BDNF ( 14 ). Hemos demostrado que ocurrieron estos efectos, al menos en parte, a través de las acciones de miR-132 en la proteína GTPasa de la activación, p250GAP, que inhibe las actividades de Rac y Cdc42.Estudios posteriores utilizando culturas más maduras mostraron que el miR-132 y p250GAP mediadas el crecimiento y la formación de la columna vertebral dendríticas inducida por la despolarización y la actividad sináptica ( 15 , 16 ). Por lo tanto, hemos propuesto que el miR-132 era a la vez necesaria y suficiente para los cambios de actividad estimulada en la formación y el crecimiento de la espina dendrítica en cultivos neuronales. Otros microRNAs median efectos similares en la cultura ( 17 - 19 ), sin embargo, no se ha determinado si el miR-132 o cualquiera de estas otras microRNAs tienen estas acciones en vivo.
Ratones knockout han demostrado ser una excelente herramienta para el análisis de la función génica in vivo. Sin embargo, son pocos los microRNAs cerebro se han estudiado el uso de este método, en gran parte por razones técnicas. Muchos microRNAs cerebrales, como miR-124, se transcriben a partir de múltiples localizaciones en el genoma, lo que complica la generación de knockouts eficaces. Algunos microARN del cerebro, tales como el miR-134, se encuentran en grupos, lo que hace difícil para borrar un microARN sin afectar a la expresión de otros. En otras situaciones, como se ejemplifica por el miR-9 y -9 *, funciones biológicas se han atribuido a ambas hebras de la microARN, lo que complica la interpretación de los cuales microARN es responsable de un resultado particular ( 20 ). miR-132, sin embargo, se transcribe a partir de sólo un único locus y se genera a partir de un precursor que codifica sólo un número limitado de otros microARN. Para determinar cuál de los cuatro microRNAs potenciales se genera a partir del locus miR-212/132, hemos desarrollado un conjunto de sensores radiométricos bidireccionales que eran capaces de distinguir sus actividades en la resolución de una sola célula. Ablación del locus miR-212/132 reduce drásticamente la longitud dendrítica, ramificación y densidad de la columna vertebral en las neuronas del hipocampo de recién nacidos en los ratones adultos jóvenes. Además, se muestra que el miR-132 es el producto primario funcional del locus miR-212/132 en estas células, lo que sugiere que es un mediador clave de la fenotipo dendríticas.

Resultados

Generación de un miR-212/132 Floxado Mouse.

 
miR-132 se encuentra a 200 bases abajo de miR-212 en Ensembl ENSMUSG00000065537 Identificación de genes. CREB y Canonical factor de RE1-silenciar la transcripción (REPOSO)-sitios de unión se encuentran entre las dos secuencias de microARN, y dos sitios de unión a CREB adicionales se encuentran ~ 100 y 150 bases aguas arriba ( . Fig. 1 A ). Hemos generado un vector de dirección con los sitios LoxP paralelas 0,4 kb aguas arriba y aguas abajo del gen de miR-132, creando un brazo de LoxP que abarca 0,8 kb de la primera intrón. Un casete PGK-neo-PA flanqueado por objetivo el reconocimiento flipasa (FRT) sitios se incluyó para la selección clonal. Después de la selección con neomicina y la confirmación del sitio de integración correcta por Southern blot, las células ES clonales fueron inyectadas en ratones Balb / C blastocistos. Los ratones quiméricos se cruzaron en un ratón C57Bl6, y la transmisión de la línea germinal del locus floxed fue confirmada por PCR.Expresión de maduro de miR-132 y miR-212 en la corteza de los ratones floxed se redujo en 46% y 69%, respectivamente ( . Fig. 1 C ), y se produjo una reducción similar en el hipocampo ( . Fig. S1 ).Presumiblemente, este fenotipo hypomorphic es causada por la retención de la casete de neomicina. El homocigotos floxed se encontraron ratones miR-212/132 para ser viables, fértiles y macroscópicamente normal. La expresión de maduro de miR-132 era considerablemente más alta que la expresión de miR-212 en estos ratones, así como en el control de la cepa C57Bl6 ( . Fig. 1 C ). Cruzando el ratón floxed con un ratón Deleter-Cre ubicua causado supresión genómica del locus miR-212/132, según la evaluación de la PCR y la expresión completamente eliminado de madura miR-132 y miR-212 ( . Fig. 1 B y C ).
La figura. 1.
Generación y validación de los ratones miR-212/132 floxed. A ) Esquema de miR-212/132 vector dirigido antes y después de la escisión mediada por Cre. Los ratones floxed tienen un casete PGK-neo aguas arriba del locus miR-212/132. Un sitio de unión REST se encuentra entre CRE1 y CRE2 y entre miR-212 y CRE3.B ) análisis de PCR que muestra que el alelo floxed se escinde sólo cuando Cre está presente (carril 1) en ratones heterocigotos floxed. C ) maduro de miR-132 y miR-212 se reducen en la corteza de ratones floxed en comparación con ratones C57BL6 / J y están ausentes en los ratones knockout generados por el cruce el ratón floxed con un ratón Deleter-Cre (miR-132: 2,15 = 20,3,P <0,001, test de Tukey post hoc, P <0.01 para todas las comparaciones; miR-212: 2,15 = 98,8,P <0,001, test post hoc de Tukey, P <0.01 para todas las comparaciones; error barras muestran SEM). No hubo ningún cambio en el nivel de miR-16, un microRNA no relacionado.

Knockout de miR-212/132 en Newborn las neuronas del hipocampo Disminuye dendríticas longitud y arborización.

Para determinar si el miR-132 influye en la longitud dendrítica y arborización en vivo, hemos estereotácticamente inyectamos el giro dentado del homocigotos floxed ratones miR-212/132 con un retrovirus que expresa una proteína de fusión GFP-Cre ( 21 ). El retrovirus GFP-Cre era activo cuando se inyecta en el giro dentado, tal como se comprueba por su efecto sobre los ratones que contienen un alelo de parada floxed aguas arriba de YFP en el locus ROSA26 ( Fig.. S2 ) ( 22 ). Junto con el retrovirus GFP-Cre, que coinjected un retrovirus que expresa mCherry, lo que permitió la visualización y cuantificación de la longitud dendrítica, ramificación, y las espinas. Ratones C57BL6 / J también fueron inyectados con el virus mCherry solo como control. Para promover la neurogénesis del hipocampo ( 4 ), los animales fueron alojados en una rueda para correr a partir del 1 d antes de la inyección hasta que fueron asesinados 21 d después de la inyección. Longitud dendrítica y arborización se cuantificaron en las neuronas de los ratones recién nacidos floxed coexpressing GFP-Cre y mCherry (Flox-Cre) y se compararon con las neuronas recién nacidas vecinos en la misma imagen que expresa mCherry solo (Flox-Ctrl), así como con las neuronas recién nacidas en C57Bl6 / J ratones que habían sido inyectados con el virus mCherry solo (WT) (. Fig. 2 ). El virus de GFP-Cre no tuvo ningún efecto sobre las neuronas recién nacidos (WT . Fig. S3 ). Las neuronas recién nacidas Flox-Cre habían disminuido drásticamente glorietas dendríticas en comparación con vecinos neuronas Flox-Ctrl. Además, las neuronas Flox-Ctrl (que expresan la mitad de los niveles de miR-132 y miR-212 como neuronas WT) habían disminuido longitud y pérgolas en comparación con los ratones WT, lo que sugiere que el grado de crecimiento dendrítico depende del nivel de miR- 212/132 los productos. Longitud total dendríticas se redujo en un 33% en el Flox-Ctrl y 76% en las neuronas recién nacidas Flox-Cre relativos a las neuronas WT ( Fig. 2. T ; n = 27 o 28 células de tres o cuatro ratones; ANOVA de una vía, 2,79 = 83,9, P <0,001, test de Tukey post hoc, P <0,001 para todas las comparaciones). Dendrítica total ramificación disminuyó en un 31% en el Flox-Ctrl y en un 66% en las neuronas recién nacidas Flox-Cre relativos a las neuronas WT ( Fig. 2. A - F y H , un modelo lineal, 2,79 = 68,0, P <0,001, test de Tukey post hoc, P <0,001 para todas las comparaciones). Para asegurarse de que las neuronas recién nacidas Flox-Cre, que a menudo tenían sólo una dendrita, no eran células gliales radiales, que immunostained para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), Doublecortin (DCX), y la proteína específica de neuronas NeuN. Se encontró que el 96% de Flox-Cre neuronas recién nacidas costained con NeuN, y 90% costained con DCX, mientras que no hay neuronas recién nacidas costained con GFAP, lo que sugiere que las neuronas Flox-Cre son de hecho las neuronas granulares inmaduras y células gliales no radiales ( Fig. S4 ). En general, estos resultados indican que los microRNAs codificados por el locus miR-212/132 regulan la longitud dendrítica y arborización en las neuronas del hipocampo recién nacidos in vivo.
La figura. 2.
Pérdida de miR-212/132 disminuye la longitud dendrítica y la ramificación de las neuronas recién nacidas en el hipocampo adulto. Neuronas representativos se muestran 21 d después de la inyección. A ) C57Bl6 / J del ratón inyectado con el virus de mCherry. C y E ) Floxado miR-212/132 ratón inyectados con mCherry y GFP-Cre. C muestra una neurona de un ratón floxed que no coexpresan GFP-Cre.) ( B , D , F y H ) de ramificación dendrítica disminuye en Flox-Ctrl y ratones Flox-Cre ( 2,79 = 68,0, P <0,001; prueba de Tukey post hoc, P <0,001 para todas las comparaciones). T ) Longitud total dendrítica en las neuronas disminuye Flox Flox-Ctrl y Cre-( 2,79 = 83,9, P <0,001, test post hoc de Tukey, P <0,001 para todas las comparaciones; barras de error muestran SEM).
A continuación examinó si los productos de la locus miR-212/132 afectados la formación de la espina dendrítica. La severidad del fenotipo dendríticas nos impidió la evaluación de la densidad de la columna vertebral en muchas neuronas recién nacidos Flox-Cre porque carecían de dendritas secundarias y su árbol dendrítico apenas extenderse más allá de la capa de células granulares ( . Fig. 2 C ). En consecuencia, se cuantificó la densidad de la columna vertebral en las dendritas de segundo y tercer orden en el medio interior de la capa molecular. Neuronas Flox-Cre que habían dendritas secundarias tenido una disminución del 24% en la densidad de la columna vertebral en comparación con las neuronas WT y una disminución del 20% en comparación con las neuronas recién nacidas Flox-Ctrl ( Fig. S5. ; n = 30 dendritas de tres o cuatro ratones, de un solo sentido ANOVA, F 2,87 = 11,1, P <0,001, test de Tukey post hoc, P<0,01 WT o Flox-Ctrl comparación con Flox-Cre).

miR-132 es la predominante microRNA Generado Del miR-212/132 Cluster.

 
La deleción del locus miR-212/132 ablación cuatro microRNAs potenciales, miR-132, -212, -132 y -212 * *. Para determinar cuál de estos microRNAs son funcionalmente importantes en las neuronas del hipocampo recién nacidos, hemos desarrollado un conjunto de sensores radiométricos bidireccionales capaces de distinguir cada posible microRNA. Estos sensores disponen de un promotor bidireccional de expresar simultáneamente distintas transcripciones que codifican una proteína verde fluorescente de Aequorea coerulscens (acGFP) y una proteína fluorescente de color rojo, Discosoma sp . Express-1 (DsRedEx1) ( . Fig. 3 A ). En la 3 'UTR de la transcripción acGFP, incorporamos tres elementos de reconocimiento microARN perfectamente complementarios (ERM) que correspondían a la microARN madura de interés ( Fig.. 3 Una ). Por lo tanto, el nivel de expresión acGFP refleja la actividad de la micro ARN en una célula particular. Hemos minimizado los efectos de los niveles de expresión variables y la regulación transcripcional no específica mediante la normalización de el nivel acGFP a la DsRedEx1 expresado internamente que carecía de MRE. Este enfoque proporcionó una medida radiométrica que representa la actividad de la micro ARN específico con la resolución de una sola célula.
La figura. 3.
Sensores radiométricos para la actividad del microRNA. (A ) Un promotor bidireccional (Bi-CMV) impulsa simultáneamente la expresión de acGFP cuya 3 'UTR contiene tres MRE. DsRedEx1 se expresa en la dirección antisentido como control interno. Elementos de embalaje lentivirales incluyen psi y libre inactivar (SIN) LTR. B ) Las células de neuroblastoma SH-SY5Y que expresan el sensor 132-MRE fueron transfectadas con cantidades cada vez mayores (hasta 10 nM total) de miR-132 mímica y una miR-SCRM mímica (rosa = 0 nM; cyan = 0,1 nM; naranja = 1,0 nM; verde = 10 nM). La relación V / R en 1 × 10 4 células individuales por condición se evaluó mediante citometría de flujo y graficada como una distribución de frecuencia acumulativa. Líneas negras y azules representan la respuesta del control negativo sensor No-ERM a las mismas concentraciones de miR-132 mímica. C ) El sensor 132-ERM respondió a la exógena (0,1 nM) de miR-132 sinóptico (azul), pero no a la altamente relacionados con miR-212 sinóptico (rojo). D ) Los sensores 132 y 212-ERM-ERM se expresaron en células SH-SY5Y en (barras negro) condiciones (1% de suero + 10 ng / ml de ácido retinoico durante 2 d) crecimiento (barras blancas) y la diferenciación. Las relaciones de T / R se normalizaron a la del control negativo SCRM-ERM. E ) La adición de inhibidores de 2'O-metil específicos de miR-132 confirmó que el sensor 132 detecta-ERM endógena de miR-132 en células SH-SY5Y. F ) Las mismas concentraciones de los inhibidores 2'O-metilo no afectó la expresión del vector de control No-MRE.
Para evaluar su rango dinámico, expresamos el sensor de miR-132 (132-MRE) con cantidades crecientes de miR-132 mímica en células de neuroblastoma SH-SY5Y y flujo utilizado la citometría de obtener mediciones radiométricas verde / rojo (G / R) en 1 × 10 4 células individuales de rojo positivo por condición (. Figura 3 B ). Una proporción G / R disminuido indica la actividad del microRNA. En particular, se detectó endógena miR-132 en estas células ( . Fig. 3 B , líneas de color rosa en comparación con las líneas negras) y se observó una reducción dosis-dependiente en la medida G / R de 132-MRE que correspondía a cantidades crecientes de expresadas miR- 132 (mímicos . Fig. 3 B , cian, naranja, verde y líneas, respectivamente). Es importante destacar que el miR-132 imitador no tuvo efecto en un sensor de control que carecía de MRE (designados "No-MRE"; . Fig. 3 B , líneas de color azul oscuro en comparación con las líneas negras). Sensores para miR-212 y miR-212 * tuvieron respuestas similares, lo que indica que los dos pueden emplearse para detectar sus microRNAs afines ( . Fig. S6 A ). MRE que contienen desajustes en las posiciones 9-11 respondieron de la misma manera pero con un rango dinámico más estrecho.
Para evaluar su especificidad, hemos probado varias combinaciones de sensores y imita microARN. Es importante destacar que la expresión de microARN imita revueltos (miR-SCRM) no cambió las relaciones, y los imitadores son altamente específicos para sensores particulares ( . Fig. S6 B ). Notablemente, 132-ERM incluso podría distinguir entre ectópica expresó miR-132 y miR-212 (imita . Fig. 3 C ), que tienen secuencias idénticas de semillas y cuyas secuencias madura diferir por sólo cuatro nucleótidos ( . Fig. S6 C ). El uso de ensayos Taqman, se confirmó que la expresión endógena de miR-132 y miR-212 cayó dentro del rango de la capacidad de los sensores para distinguir los imita ectópica expresadas ( . Fig. S7 A ).
Estamos próximos a prueba si los sensores pueden detectar la actividad del microRNA inducido. El uso de ensayos TaqMan, habíamos detectado miR-132 y un nivel mucho más bajo de miR-212 en las células SH-SY5Y en condiciones basales ( . Fig. S7 B ). El tratamiento con ácido retinoico producido equivalentes desplegables aumentos tanto en miR-132 y miR-212, sin embargo, el nivel absoluto de miR-132 fue considerablemente mayor ( Figura S7. B ). Aplicamos nuestros sensores con el mismo paradigma y, en condiciones basales, vimos una relación V / R disminuyó entre 132-MRE y un sensor con un MRE revueltos (SCRM-MRE) y no hubo diferencia significativa entre SCRM-MRE y 212-MRE ( la figura. 3 D ). Tras el tratamiento con ácido retinoico, la relación V / R de 132-ERM se redujo aún más, y se observó una disminución pequeña pero significativa de la relación V / R en 212-ERM ( . Fig. 3 D ). Esta observación sugiere que los sensores son capaces de detectar la actividad de microARN endógena e inducible. Para confirmar que la disminución de la relación V / R observada fue el resultado de miR-132 de actividad, hemos utilizado concentraciones crecientes de un 2'O-metil miR-132 y inhibidor observado un retorno correspondiente de la relación de nuevo a la n-ERM control de sensor ( . Fig. 3 E ). Es importante destacar que, el inhibidor no tuvo efectos significativos sobre el control del sensor n-ERM ( . Fig. 3 F ).
Para establecer la especificidad y la sensibilidad de los sensores en neuronas primarias, se realizaron ensayos de Taqman para miR-132 y miR-212 en una población de neuronas del hipocampo disociadas que había sido recién disecados o cultivadas durante 4 d. En ambos casos, se observó una mayor abundancia de miR-132 que miR-212 ( . Fig. 4 A ). Para supervisar la actividad de cada microRNA, introdujimos los sensores 132-MRE, 132 *-MRE, 212-MRE, y 212 *-ERM en cultivos de hipocampo disociadas y usamos la citometría de flujo para analizar la relación V / R ya sea al día siguiente o después de cultivar durante 3-5 d in vitro (DIV 3-5) ( Fig. 4. B - E ). Aproximadamente 1-5 × 10 3 células vivas rojo-positivo individuales se evaluaron por condición para cada experimento, y los experimentos se repitieron con siete culturas diferentes. En DIV 1, no observamos diferencias significativas en la relación V / R para cualquiera de los microRNAs. Por el contrario, en el DIV 3-5 los sensores reportan un nivel significativo de miR-132 actividad, pero no detectaron importantes miR-132 *, -212, -212 * o actividad ( Fig. 4. B - E ). Este resultado se confirmó mediante microscopía confocal cuantitativo de las neuronas individuales en DIV 1 ( . Fig. S8 ) y DIV 4 ( . Fig. 4 C ) en el que se calibraron condiciones de formación de imágenes sobre la base de sólo-verde y controles de sólo rojos ( . Fig. S9 ). Por otra parte, el predominio de miR-132 en la actividad de estas neuronas se extendió a DIV 17 ( . Fig. S8 ).
La figura. 4.
miR-132 es el producto funcional predominante del locus miR-212/132 en las neuronas del hipocampo primaria. (A ) ensayos TaqMan de DIV 0 y 4 disociaron cultivos de hipocampo medir la abundancia relativa de maduro de miR-132 y miR-212. B - E ) Sensores (barras negras) para cada uno de los microARN putativo desde el locus miR-212/132 se expresaron en cultivos de hipocampo disociadas y evaluaron con citometría de flujo después de DIV 1 o DIV 3-5. Los ratios de la mediana de T / R de 5 × 10 3 neuronas se normalizaron a la de los sensores de control (barras blancas) en el mismo experimento, y el SEM de siete culturas se muestra. ** P <0,01; ANOVA P<0,001. F ) confocal de imágenes representativas de los sensores en DIV 4 neuronas. Control de SCRM-MRE corresponde a C. elegans miR-239b.
Para determinar si el miR-132 fue responsable del crecimiento dendrítico, arborización, y la columna vertebral fenotipos observados en las neuronas recién nacidas, pedimos que los microRNAs fueron activos en las neuronas DCX-positivos en el giro dentado del adulto joven C57Bl6 / J ratones. La expresión de la proteína fluorescente de color rojo de la cadena (-) era insuficiente para controlar las células transducidas después de la infección lentiviral, así que compara el porcentaje de neuronas DCX-positivas que expresa GFP (que indica una baja actividad de microARN) después de la infección con igualdad de títulos de sensores lentivirales . Con el control de SCRM-MRE, el 36% de las células DCX-positivos mostró que la expresión de GFP ( . Fig. 5 ), y un porcentaje similar se observó para el 212-MRE, 132 *-MRE, y 212 sensores *-ERM. Sin embargo, sólo el 4% de las células DCX-positivos en ratones inyectados con el sensor 132-MRE expresó GFP, lo que indica que el miR-132, pero no miR-132 *, -212, -212 o *, es activa en las neuronas granulares inmaduras . Por lo tanto, proponemos que la falta de miR-132 se hace responsable de los cambios fenotípicos en las neuronas recién nacidas adultos.
La figura. 5.
miR-132 es el producto primario funcional del locus miR-212/132 en neuronas granulares inmaduras en vivo. La circunvolución dentada de los ratones PESO fue estereotácticamente inyecta con sensores de microARN lentivirales, y las neuronas granulares inmaduras se detectaron con tinción DCX (Alexa Fluor 647). A ) La media del porcentaje de neuronas DCX-positivas que también expresan GFP ( 4106 = 23.4; comparación múltiple de Dunnett prueba post hoc ** P <0,01; barras de error muestran SEM). B ) las imágenes confocales representativos ( n = 15 secciones de dos o tres ratones por condición).

Discusión

Los microARNs son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y para el establecimiento de la conectividad funcional del cerebro, como se evidencia por la disminución de la complejidad dendrítica, alteración de la morfología columna vertebral, y los defectos cognitivos causados ​​por la interrupción de la maquinaria de procesamiento de microARN ( 23 , 24 ). La vinculación de los microRNAs individuales a funciones específicas del cerebro ha sido difícil, especialmente en el contexto de animales intactos. Como resultado, la mayoría de estudios se han basado en modelos de cultivos celulares y han utilizado imita microARN, inhibidores o esponjas ( 25 ), todos los cuales tienen el potencial de efectos fuera de la meta y pueden producir fenotipos parciales. Además, estos enfoques tienen un historial mixto en recapitular los efectos de agujeros ciegos genéticos o incluso puede tener efectos opuestos ( 26 , 27 ). Generación de modelos knockout ha sido un reto porque microRNAs cerebrales a menudo se transcriben a partir múltiples loci genéticos o se encuentran dentro de las agrupaciones.
La ablación de miR-212/132 es comparativamente simple porque una sola deleción afecta, a lo sumo, cuatro microARN potenciales. Sin embargo, la comprensión de una deleción tales requiere establecer cuál de los cuatro microARN desde el locus miR-212/132 son funcionales. Para abordar esta cuestión, hemos desarrollado una serie de sensores fluorescentes ratiometric específica para cada posible microRNA.Sorprendentemente, los sensores revelaron que sólo uno de los cuatro potencial microARN miR-132, es funcional en las neuronas del hipocampo. Por lo tanto, podríamos utilizar la cepa de ratón knockout condicional que hemos desarrollado para determinar la función de solo miR-132.
Para determinar las consecuencias de la supresión de la locus miR-212/132 in vivo, se examinaron las neuronas recién nacidas dentro de los jóvenes hipocampo adulto. Neurogénesis hipocampal es exquisitamente sensible a las tareas espaciales de aprendizaje, la exposición a un ambiente enriquecido, y el ejercicio físico. Los estudios han mostrado grandes cambios en la formación de la arborización y la espina dendrítica en las neuronas recién nacidas que persisten durante varios meses después del entrenamiento por sólo 6 d en un laberinto de agua de Morris ( 3 ). Esta plasticidad morfológica es mucho más evidente en las neuronas recién nacidas que en neuronas maduras, que nos proporciona un sistema sensibilizado para examinar la contribución de miR-132.
Para probar si el miR-132 regula la maduración dendríticas in vivo, inyectamos retrovirus Cre-expresando en el giro dentado del floxed miR-132 ratones y examinamos la morfología de las neuronas recién nacidas.Mediante el uso de la infección retroviral Cre, podríamos prevenir la expresión de microARN de forma aguda, lo que elimina la posibilidad de compensar los efectos durante el desarrollo cerebral que puede ocurrir con un nocaut en la línea germinal. Neuronas recién nacidos que expresan Cre tenían una profunda fenotipo dendríticas que se caracteriza por una reducción en la longitud dendrítica, de ramificación, y densidad de la espina. En particular, nuestros sensores confirmaron que la actividad de miR-132 predominó en estas neuronas específicas. Junto con nuestros hallazgos anteriores, estos resultados sugieren que el miR-132 juega un papel importante en el desarrollo neuronal y la maduración in vivo.
La pérdida de la señalización de CREB se ha demostrado que es perjudicial crecimiento dendrítico y arborización de las neuronas del hipocampo recién nacidos ( 11 ). Nuestros resultados demuestran que la ablación de una sola diana de CREB, miR-212/132, provoca un fenotipo dendrítica similar en las neuronas del hipocampo recién nacidos, lo que sugiere que los microRNAs de este locus median algunos de estos efectos CREB. Esta idea es coherente con nuestros experimentos previos utilizando cultivos neuronales en el que hemos encontrado que los inhibidores de miR-132 comandos en gran medida los efectos de CREB en la maduración de las dendritas. Anteriormente, habíamos identificado p250GAP como objetivo mediar miR-132 efectos sobre el crecimiento de dendrítica en las neuronas cultivadas; si p250GAP es suficiente para estos efectos in vivo está bajo investigación. Otros miR-132 objetivos han sido identificados, incluyendo la proteína de unión a metil-CpG 2 (MeCP2), p120RasGAP, y P300 ( 28 - 30 ), y será interesante para determinar si alguno de ellos contribuyen al fenotipo dendríticas.
Además de su papel en la maduración de dendritas, de CREB es necesario para la supervivencia de las neuronas granulares del recién nacido ( 10 ). Por lo tanto, será importante para determinar si la supervivencia de neuronas recién nacido depende de miR-132. Los efectos de miR-132 en el crecimiento dendrítico y la supervivencia neuronal podrían ser interdependientes; una gran proporción de las neuronas del hipocampo recién nacidos se someten a la apoptosis ( 31 ), y la supervivencia puede depender de si las neuronas inmaduras se vuelven funcionalmente integrados en los circuitos. Un fenotipo dendríticas severa causada por la pérdida de la señalización de CREB o expresión de miR-132 podría impedir la integración, lo que hace que estas células sean más susceptibles a la eliminación.
Dos artículos recientes implicados estriatal miR-212 como un componente esencial del mecanismo que subyace a la adicción a la cocaína ( 32 , 33 ). Nuestros datos indican que madura miR-132 se expresa a un nivel significativamente más alto que madura miR-212 en el hipocampo y la corteza. Aunque los bajos niveles de expresión madura de miR-212 podrían ser detectados, actividad funcional, tal como se mide usando los sensores, es mínima en condiciones basales, lo que sugiere un umbral de potencial ( 34 ). Sin la información proporcionada por los sensores de microARN, que habría sido difícil de descartar la posibilidad de que el bajo nivel de miR-212 expresión los resultados de diferentes eficiencias de cebadores de PCR.Sin embargo, la expresión de datos y sensores combinados indican que el miR-212 niveles son considerablemente más bajos que los de miR-132. Si los niveles de miR-212 son suficientes para mediar una respuesta funcional es incierto. Una ventaja de los sensores es que permiten la supervisión de la actividad de microARN específico en las células individuales, como se demostró usando el marcador de neuronas inmaduras, DCX. Será interesante determinar si miR-212 es funcionalmente activa en dorsal neuronas estriadas.
En conclusión, hemos demostrado que el miR-132 media la extensión dendrítica de las neuronas recién nacidas en el hipocampo adulto in vivo. Además, hemos demostrado que el miR-132 es el producto primario funcional del locus miR-212/132 en ambos cultivos de hipocampo y neuronas granulares recién nacidos.Por lo tanto, hemos identificado un mecanismo por el que la señalización a través de CREB microARN puede promover el crecimiento y maduración de las neuronas recién nacidas en el hipocampo. Futuros estudios dilucidar la generalidad de esta vía y la forma en que puede ser la base los cambios dependientes de la actividad en otras partes del cerebro.

Materiales y Métodos

Ratones Floxado miR-132/212 fueron generados por Ozgene. Inyecciones estereotácticas se realizaron como se ha descrito previamente ( 35 ). El retrovirus CAG-GFP-Cre ( 21 ) fue un generoso regalo de F. Gage (Salk Institute, La Jolla, CA). Detalles experimentales completos para la generación de ratones, virus, cultivo celular, inmunohistoquímica, de formación de imágenes, y citometría de flujo se pueden encontrar enMateriales y Métodos SI . Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de la Oregon Health and Science University Institucional Cuidado de Animales y uso.

Agradecimientos

Damos las gracias a Brian Druker y el Instituto del Cáncer Knight de la Oregon Health and Science University para acceder a la clasificación de células Aria II. La microscopía confocal y análisis se llevaron a cabo en la Advanced Light Microscopy Core en la Oregon Health and Science University Jungers Center.Los retrovirus se envasaron en el Core Laboratory Vollum Viral. Agradecemos Rukayat Taiwo para la asistencia experimental con inyecciones in vivo, inmunohistoquímica y análisis de imágenes. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones NS067811 y P30NS061800, el Instituto Médico Howard Hughes, y un Premio al Investigador Joven NARSAD (a BWL).

Notas al pie

  • 2 ¿A quién puede dirigirse la correspondencia. E-mail: magills@ohsu.edu o goodmanr@ohsu.edu .
  • Contribuciones de los autores: MCI, XAC, BWL, DTL, GM, y RHG investigación diseñada; MCI, XAC, BWL y BHL cabo la investigación; BWL y GLW aportaron nuevos reactivos / herramientas analíticas; STM, XAC, DTL, GM, y RHG analizados datos, y STM, XAC, GLW, GM, y RHG escribió el documento.
  • Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
  • Este artículo contiene información de soporte en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1015691107/-/DCSupplemental .

Referencias

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