jueves, 27 de febrero de 2014

Un estudio examina los estereotipos de alemanes y españoles



La intuición es visto tradicionalmente como femeninas y la razón masculina se compara. Pero todavía existen estos estereotipos? ¿Los alemanes todavía creen que las mujeres con mayor intuición en cuanto a la gente que los hombres? Estas son las preguntas que los científicos Gerd Gigerenzer según el Instituto Max Planck para el Desarrollo Humano.
¿Quién tiene una mejor intuición - Mujeres, hombres, o no hay ninguna diferencia? Esta fue la pregunta que un grupo de investigadores de Berlín total de 1.016 hombres y mujeres alemanes. Se fueron los dos a la vida privada y profesional. Los resultados son sorprendentes: Cuando se trata de elegir el compañero de vida adecuado, la mayoría de las mujeres está convencido de que tienen la mejor intuición. Y los alemanes están de acuerdo con ellos. Sólo el 14 por ciento de los hombres confían en su propia intuición en la búsqueda de un socio. La misma imagen aparece en otras cuestiones personales.
¿Qué tan diferente son hombres y mujeres de confirmación significa los resultados en detalle.Haga Click para agrandar
Cuán diferente son hombres y mujeres de confirmación significa los resultados en detalle.
La situación es muy diferente, sin embargo, a partir de, por ejemplo, la compra de acciones en la bolsa de valores. Sólo el 11 por ciento de las mujeres piensan que les ofrece una mejor intuición - y aún menos los hombres les confía a eso. ¿Estos estereotipos reflejan la realidad? En el mercado de renta variable, este no es el caso. Debido a que los hombres tienden a tener más conocimiento, pero no la mejor intuición: Otros estudios no muestran diferencias o incluso un poco más inversiones exitosas por parte de mujeres.
Esta asombrosa uniformidad de los estereotipos de hombres y mujeres, pero se rompe en un área de la interacción social en el lugar de trabajo. Ya no existe este partido y la polarización. ¿Se trata de que los empleados de Administración, los hombres creen más en su intuición como a la hembra. Para las mujeres, sin embargo, es al revés: No creen en la mayoría de la intuición masculina en el trato con los empleados.Una gran parte, sin embargo, no ve ninguna diferencia entre los sexos.
Un resultado inesperado fue el análisis de las edades: jóvenes como mayores alemán tenían los mismos estereotipos sobre la intuición. "Esto indica que aún estamos lejos de un trato inteligente con la intuición. Casi todos los gerentes y el médico se reúne constantemente decisiones viscerales, pero tienen miedo al público a decir. La intuición es todavía sinónimo de arbitrariedad, un sexto sentido, o de la naturaleza femenina ", dice el autor principal Gerd Gigerenzer, director del Instituto Max Planck para el Desarrollo Humano.
¿Son los mismos estereotipos de otros países? En cooperación con la Universidad de Granada en España, los investigadores del Instituto Max Planck también han contratado a una comparación entre países. Las mujeres y los hombres españoles vieron menos diferencia entre los sexos de los alemanes, sobre todo en áreas que afectan a la profesión. Y, a pesar de la igualdad de género en Alemania supuestamente tiene una prioridad más alta. "Los españoles piensan acerca de la intuición menos estereotipada que los alemanes. Esto nos sorprendió por el papel tradicional, más conservadora de las mujeres en España, que fue dominada por el régimen franquista hasta mediados de los años 70 ", dijo Gerd Gigerenzer.
Realidad: Aunque hay más mujeres que supuestamente tratan como Alemania empleada que en España, pero a tiempo parcial más a menudo. Al mismo tiempo se siente más españoles que en las mujeres alemanas en las primeras posiciones.Los estereotipos sobre la intuición de las mujeres pueden ser una de las razones por las que en Alemania son relativamente pocas mujeres en la alta dirección de la empresa y la ciencia.
SB

Piensa antes de hablar

En las conversaciones cotidianas, a menudo hemos empezar a hablar antes de que nos hemos determinado exactamente lo que decimos y cómo queremos formularlo. Esto plantea la cuestión de cómo el pensamiento y el habla están coordinados en el tiempo. ¿Hasta dónde piensa portavoz delante? Los científicos dirigidos por Antje Meyer, del Instituto Max Planck de Psicolingüística han demostrado que esto depende de la complejidad de lo que se quiere representar lingüísticamente. Sus experimentos muestran la evolución en el tiempo de la preparación mental del contenido y la forma de la expresión se ve afectada.
Texto: Antje Meyer y Agnieszka Konopka
Podemos planear nuestras expresiones de diferentes maneras, mientras que pensar en el futuro en diferentes grados.Haga Click para agrandar
Podemos planear nuestras expresiones de diferentes maneras, mientras que pensar en el futuro en diferentes grados.
"Piensa antes de hablar!" Este consejo bien intencionado que escuche lo general, después de que uno ya ha conseguido a sí misma en problemas o se ha divulgado un secreto cuidadosamente guardado. Esto no es sorprendente: se sabe de hecho desde hace mucho tiempo que los hablantes raramente avanzan cuidadosamente acerca de lo que quieren decir. En lugar de ello, planean su mayoría sólo el comienzo de un enunciado, empezar a hablar y planificar más, mientras pronuncian el principio de una oración. Esto funciona porque la planificación del habla, así que elegir las palabras adecuadas y su disposición en el conjunto que se ejecuta más rápido que el debate en sí lo tanto es necesario, por ejemplo, al menos 1,5 segundos para "... La niña", dicen las palabras . Esto le da tiempo suficiente para la siguiente parte de la frase, como "... el muchacho empuja" al plan.
Si el tiempo de planificación durante el debate, una frase ni siquiera suficiente, el orador hace un parón en el bloque o tal vez dice "uh" para ganar tiempo. De vez en cuando, es posible que a partir de la falta de tiempo o falta de concentración, sino también de error, como en la frase "estoy muy contenta de que te has ido!" (En lugar de "ven son"). En general, sin embargo, el pensamiento y el habla simultánea funciona muy bien y permite el cambio rápido voz en una conversación natural.

Cómo formar pensamientos?

Una cuestión importante en la psicología del lenguaje es el uso de las unidades de planificación que las personas construyen sus expresiones. En el Instituto Max Planck de Psicolingüística en Nijmegen, estamos particularmente interesados ​​en la cuestión de cómo los pensamientos se expresen, poco a poco se acumulan, si esto se hace para todos los narradores, y en todas las situaciones de la misma manera o si se Aquí hay diferencias sistemáticas. Además, tratamos de averiguar cómo la preparación mental de un enunciado se coordina con la pronunciación, en particular, hasta qué punto por delante hablantes planifican antes de que empiecen a hablar.

Los movimientos oculares muestran los procesos de planificación

A los participantes del ensayo con una cámara de movimiento de los ojosHaga Click para agrandar
A los participantes del ensayo con una cámara de movimiento de los ojos
Para investigar estas preguntas, le pedimos a los voluntarios adultos para describir escenas en su idioma nativo, holandés. Tomamos las observaciones y determinar, sobre la base de la señal de voz, cuando los sujetos comienzan a hablar y cuando lo pronuncian cada palabra en cada uno. Durante el experimento, los sujetos usan una cámara de movimiento ocular que se puede determinar en el milisegundo, cuándo y por cuánto tiempo el "agente" (es decir, el actor / el hacedor) Y "undergoer" (las de la una o ver la acción "sufren"). Este procedimiento se basa en el principio general de que por lo general se ve a donde sólo la cosa importante es ver, por lo que, por ejemplo, el hacedor, sobre las que uno quiere hablar. A partir de los movimientos de los ojos, se puede deducir, entonces, cuando alguien vuelve su atención a una parte de la imagen, la definición presumiblemente los respectivos pensamientos y quizás también recupera las palabras correspondientes de la memoria. Podemos poner las declaraciones pronunciadas en la relación y así determinar cómo los hablantes ahora planean sus declaraciones antes de que empiecen a hablar.

Estrategias de planificación de posibles

Cómo planificar hablando ahora la descripción de las acciones? Los primeros estudios en esta área han sugerido dos hipótesis: en primer lugar, que sólo podían especificar el primer concepto y la primera palabra de la expresión antes de la aparición que hablasen. Por ello, deben, tan pronto como aparezca la imagen, uno de los participantes de la acción, sobre una niña mirando, y luego comenzar de inmediato a hablar. Las siguientes palabras en el enunciado entonces serían programados después. En segundo lugar, ya se podrían establecer más o menos antes del comienzo de la emisión, lo que está sucediendo en la imagen, así que ¿quién está haciendo qué. Entonces ellos primero deben considerar tanto los participantes de acción (el niño y la niña) y quizás otras partes de la imagen (como un carro). En el primer caso, sólo un simple concepto se define, mientras que ya una estructura conceptual más complejo se forma en la segunda declaración del caso antes de comenzar.
Una tercera posibilidad, que antes eran ignorados es que habla ni lo uno ni coherente que usar la otra estrategia, pero que en la planificación del habla depende de la dificultad de la tarea. Así podría reducir, por ejemplo, con el aumento de las unidades de planificación dificultad. Con el fin de probar la última hipótesis, utilizamos imágenes en las que las acciones eran o fáciles de identificar y de describir o difícil. También la visibilidad de la persona se varía. A los sujetos se dan instrucciones específicas sobre el tipo y la duración de las descripciones.

Los oradores son flexibles

Las proporciones de las fijaciones (Mira) para el agente (hacedor) y patientive (objeto de la acción) al describir situaciones sencillas (a) y las situaciones más difíciles (b).  La expresión oral se inicia con situaciones sencillas un poco más tarde que en los más difíciles (línea vertical en las figuras), ya que más pre-planeado en el primer caso.Haga Click para agrandar
Las proporciones de las fijaciones (Mira) para el agente (hacedor) y patientive (objeto de la acción) en la descripción más fácil ... [más]
Se encontró que el comportamiento de la mirada de los sujetos y por lo tanto la evolución en el tiempo de sus procesos de planificación intelectuales y lingüísticas en realidad depende de la dificultad de la descripción de la tarea.Parte de los resultados (es decir, las descripciones con personas reconocibles Fácil) se muestra en la Figura 3 se muestra. Aquí es para cada punto de tiempo después de la aparición de imagen indica qué proporción de todos los puntos de vista del agente (negro) y el undergoer (gris) se omitió. Los estados comenzaron después de aproximadamente 1,8 a 2 segundos. En general, los temas considerados inicialmente en lugar del agente como la undergoer. Pero si la acción era simplemente para describir la preferencia por el agente no fue muy pronunciada.Se puede ver que que la línea de negro en el inicio (hasta alrededor de 600 milisegundos) es sólo ligeramente por encima del gris era. Los sujetos entonces considerado el agente preferido que por lo general se menciona por primera vez, y entonces el patientive, que fue nombrado como el segundo.Este patrón muestra que los sujetos inicialmente adquirieron una visión general de lo que está sucediendo (y, a menudo, tanto el agente y el patientive considerado) y una estructura mental formada, y luego, mientras que eligieron las palabras individuales de su léxico mental, la serie después de volver a las dos personas.
Si el delito se opuso a describir severa, los sujetos limitados desde el principio más a la consideración del actor. La fase de la visión general representó en gran medida. 
Estos y otros análisis mostraron que los sujetos no han utilizado una estrategia de planificación rígida, pero - dependiendo de la situación - diferente planeado.La situación era fácilmente manejable, se formaron antes del comienzo de la expresión de una estructura mental compleja. Para las situaciones más complejas o más débiles que inicialmente se centraron más en una acción que los participantes y planearon la otra parte de la declaración más tarde.
Podemos controlar nuestra forma de hablar por lo que planificar de varias maneras mientras pensando en el futuro en diferentes grados. Además, se puede elegir entre una gran vocabulario. Ambos - la flexibilidad en la planificación de estrategias y la flexibilidad en la elección de lo que se dice - nos ayuda a expresarnos de forma rápida y adecuada.

martes, 25 de febrero de 2014

En el ojo de un pollo, un nuevo estado de la materia está a la vista



La disposición inusual de las células en el ojo de un pollo constituye la primera aparición biológica conocida de un potencial nuevo estado de la materia conocido como "hyperuniformity desordenada", según los investigadores de la Universidad de Princeton y la Universidad de Washington en St. Louis. La investigación en la última década ha demostrado que los materiales hyperuniform desordenadas tienen propiedades únicas cuando se trata de la transmisión y el control de las ondas de luz, informaron los investigadores en la revista Physical Review E.
Estados de hyperuniformity desordenada comportan como cristal y estados líquido de la materia, para exponer a grandes distancias y el trastorno sobre pequeñas distancias. Como cristales, estos estados suprimen en gran medida las variaciones en la densidad de partículas - como en los gránulos individuales de una sustancia - a través de grandes distancias espaciales de manera que la disposición es muy uniforme. Al mismo tiempo, los sistemas de hyperuniform desordenados son similares a los líquidos en que tienen las mismas propiedades físicas en todas las direcciones.Combinadas, estas características hacen que los circuitos ópticos hyperuniform, detectores de luz y otros materiales podrían ser controladas para ser sensible o insensible a ciertas longitudes de onda de luz, según informan los investigadores.
"Materiales hyperuniform desordenados poseen un orden oculto", explicó el co-autor correspondiente Salvatore Torquato, profesor de química de Princeton. Fue Torquato, que con Frank Stillinger, científico senior en el Departamento de Química de la Universidad de Princeton, primero identifica hyperuniformity en un documento de 2003 en Physical Review E.
"Desde que hemos descubierto que este tipo de sistemas físicos están dotados de propiedades físicas exóticas y por lo tanto tienen nuevas capacidades", dijo Torquato."Cuanto más aprendemos acerca de estos sistemas desordenados especiales, más nos encontramos con que en realidad deberían ser consideradas como un nuevo estado distinguible de la materia."
Los investigadores estudiaron las células sensibles a la luz llamadas conos que son a los ojos de la mayoría de los pollos y otras aves activas durante el día. Estas aves tienen cuatro tipos de conos para el color - violeta, azul, verde y rojo - y un tipo para la detección de los niveles de luz, y cada tipo de cono es de un tamaño diferente. Los conos están empaquetados en un solo epitelial o tejido, capa llamada la retina. Sin embargo, ellos no están dispuestos en la forma habitual, según informan los investigadores.
A los ojos de muchas criaturas, las células visuales se distribuyen uniformemente en un patrón obvio como los ojos compactas hexagonales familiares de los insectos. En muchas criaturas, los diferentes tipos de conos están dispuestos de tal manera que no se encuentran cerca de los conos del mismo tipo. A primera vista, sin embargo, el ojo de pollo parece tener un disperso de conos distribuidos en ningún orden en particular.
El laboratorio del co-autor correspondiente Joseph Corbo, profesor asociado de patología e inmunología y la genética en la Universidad de Washington en St. Louis, los estudios de cómo evolucionó el diseño visual inusual del pollo. Pensando que tal vez tuvo algo que ver con la forma en que los conos están empaquetados en un espacio tan pequeño, Corbo acercó Torquato, cuyo grupo estudia la geometría y la dinámica de los objetos densos, tales como partículas.
Torquato luego trabajó con el primer autor del papel de Yang Jiao, quien recibió su Ph.D. en la ingeniería mecánica y aeroespacial de Princeton en 2010 y ahora es profesor asistente de ciencia de los materiales e ingeniería en la Universidad Estatal de Arizona. Torquato y Jiao desarrollaron un modelo de simulación por ordenador que fueron más allá de algoritmos de embalaje estándar para imitar la disposición definitiva de los conos de pollo y les permitió ver el método subyacente a la locura.
Resultó que cada tipo de cono tiene un área alrededor de ella denomina una "región de la exclusión" que otros conos no pueden entrar. Conos del mismo tipo excluidos entre sí más de lo que lo hacen a diferencia de los conos, y esta variante exclusión hace que los patrones distintivos de cono. Cada tipo de patrón de cono se superpone el patrón de otro cono de manera que las formaciones están entrelazados en una forma organizada pero desordenada - un tipo de desorden uniforme. Así que, aunque parecía que los conos fueron colocados irregularmente, su distribución era en realidad uniforme a grandes distancias. Eso es hyperuniformity desordenada, dijo Torquato.
"Debido a que los conos son de diferentes tamaños que no es fácil para que el sistema entre en un cristal o estado ordenado", dijo Torquato. "El sistema está frustrado de encontrar lo que podría ser la solución óptima, que sería la disposición ordenada típica. Mientras que el patrón debe ser desordenado, sino que también debe ser lo más uniforme posible. Así, hyperuniformity desordenada es una excelente solución."
Hallazgos de los investigadores agregan una nueva dimensión llamada multi-hyperuniformity. Esto significa que los elementos que componen la disposición son en sí mismos hyperuniform. Mientras que los conos individuales del mismo tipo parecen tener un origen distinto, en realidad están sutilmente vinculados por las regiones de exclusión, que usan para auto-organizarse en patrones. Múltiples hyperuniformity es crucial para el sistema aviar muestrear uniformemente la luz entrante, dijo Torquato. Él y sus co-autores especulan que este comportamiento podría servir de base para los materiales que se auto-ensamblan para formar un estado hyperuniform desordenado desarrollo.
"También se puede pensar en cada uno de estos cinco conos visuales diferentes como hyperuniform", dijo Torquato. . "Si yo le diera el sistema aviar con estos conos y quité el rojo, todavía hyperuniform Ahora, vamos a quitar la nada - lo que queda es todavía hyperuniform Eso nunca se ha visto en cualquier sistema, físico o biológico Si le hubieran preguntado.. me recrear este acuerdo antes de ver estos datos que podría haber dicho inicialmente que sería muy difícil de hacer ".
El descubrimiento de hyperuniformity en un sistema biológico podría significar que el estado es más común de lo que se pensaba, dijo Remi Dreyfus, investigador de las Asambleas complejos basados ​​en Pennsylvania de laboratorio Materia Blanda (COMPASS) co-dirigido por la Universidad de Pennsylvania, el Centro Nacional francés de Investigaciones Científicas y la compañía francesa de productos químicos Solvay. Anteriormente, hyperuniformity desordenada sólo se había observado en los sistemas físicos especializados, tales como helio líquido, los plasmas simples y gránulos densos.
"Realmente parece que esta idea de hyperuniformity, que se inició a partir de una base teórica, es muy general y que los podemos encontrar en muchos lugares", dijo Dreyfus, que esté familiarizado con la investigación, pero no tuvo ningún papel en ella."Creo que más y más gente va a mirar hacia atrás en sus datos y averiguar si existe hyperuniformity o no. Van a encontrar este tipo de hyperuniformity es más común en muchos sistemas físicos y biológicos."
Los resultados también proporcionan a los investigadores un modelo natural detallada que podría ser útil en los esfuerzos para construir sistemas hyperuniform y tecnologías, dijo Dreyfus. "La naturaleza ha encontrado una manera de hacer múltiples hyperuniformity", dijo. "Ahora usted puede tomar el ejemplo de lo que la naturaleza ha encontrado para crear un patrón de múltiples hyperuniform si tiene intención de hacerlo."
Evolutivamente hablando, los resultados de los investigadores muestran que la naturaleza encontró una solución única al problema de abarrotar todos los conos en el ojo aviar compacto, dijo Corbo. El modelo ordenado de las células en los ojos de la mayoría de los otros animales se cree que es el arreglo "óptimo", y cualquier cosa menos se traduciría en problemas de visión. Sin embargo, las aves con la disposición estudiada aquí - incluyendo pollos - tener una visión impecable, dijo Corbo.
"Estos resultados son importantes porque sugieren que la disposición de los fotorreceptores en el ave, aunque no perfectamente regular, son, de hecho, tan regular como se les puede dar las limitaciones de embalaje en el epitelio", dijo Corbo.
"Este resultado indica que la evolución ha conducido al sistema a la disposición" óptima "es posible, dadas estas limitaciones," dijo. "Todavía no sabemos nada acerca de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a este arreglo hermoso y altamente organizada en las aves. Así, futuras líneas de investigación incluirán los esfuerzos para descifrar cómo estos patrones se desarrollan en el embrión."
El documento, "los patrones fotorreceptoras aviar representa una solución hyperuniform desordenado a un problema de embalaje multi-escala", fue publicado el 24 de febrero en la revista Physical Review E. El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional para la Ciencia (concesión no. DMS-1211087), National Instituto del Cáncer (subvención no U54CA143803.), los Institutos Nacionales de Salud (NOS subvención EY018826, HG006346 y HG006790.), el Programa de Human Frontier Science; la Fundación Alemana de Investigación (DFG) y la Fundación Simons (concesión no 231.015.).

Junto con huevos, sopa y juguetes de goma, la lista de los legados más duraderos del pollo puede llegar a incluir materiales avanzados, según los científicos. Los investigadores informan que el arreglo inusual de las células en el ojo de un pollo constituye la primera aparición biológica conocida de un potencial nuevo estado de la materia conocido como "hyperuniformity desordenada ', que se ha demostrado que tienen propiedades físicas únicas.

viernes, 21 de febrero de 2014

Rna juegan papel crítico en la interacción huésped patogeno

RNAs pequeños juegan un papel crítico en la interacción huésped-patógeno. De hecho, pequeño RNA mediada por silenciamiento o la interferencia de ARN (ARNi) es una de las primeras formas de la inmunidad antiviral. A pesar de que representa el sistema de defensa contra los virus en muchos organismos, el papel antiviral de RNAi no ha sido claramente demostrado en los vertebrados superiores. Sin embargo, está bien establecido que su respuesta a la infección viral se basa en el reconocimiento de ARN viral por receptores de reconocimiento de patrón de acogida (PRRS) para desencadenar la activación de la vía del interferón. En el presente trabajo se reporta la existencia de una novela pequeña población de ARN no codificante producida en células de mamífero a la infección por virus de RNA. Usando Sindbis virus (SINV) como un modelo prototípico arbovirus, perfilamos la pequeña población de ARN de las células infectadas en las dos líneas celulares de mono verde humanos y africanos. Aquí, aportar pruebas de la presencia de discretos pequeños RNAs de origen viral que no están asociados con el silenciamiento de ARN inducida complejo (RISC), que están altamente expresados ​​y detectados por análisis de transferencia de Northern, y que se acumulan como 21 - a 28 - (nt) especies de nucleótidos durante la infección. Nos informan de que los L escinde antivirales celulares RNasa endoribonuclease el genoma viral, produciendo a su vez, los pequeños RNAs. Sorprendentemente, hemos descubierto la presencia de una modificación en la secuencia de nucleótidos del extremo 3 'de derivados de SINV pequeños RNAs virales (SvsRNAs) que podrían estar en el origen de su estabilidad. En conjunto, nuestros resultados muestran que los pequeños RNAs virales estables modificados podrían representar una nueva forma de modular la interacción huésped-virus tras la infección SINV.
IMPORTANCIA En una carrera de armamentos continua, los virus tienen que lidiar con respuestas antivirales de acogida con el fin de establecer con éxito una infección. En células de mamíferos, el mecanismo de defensa del huésped se basa en el reconocimiento de ARN virales, lo que resulta en la activación de interferones de tipo I (IFN). A su vez, la expresión de muchos genes estimulados por el interferón (ISGs) es inducida para inhibir la replicación viral. Aquí mostramos que la citoplasmática, inducida por interferón, endoribonuclease celular RNasa L está implicada en la acumulación de una novela pequeña población de ARN de origen viral. Estos pequeños RNAs se producen después de la infección SINV de células de mamífero y se estabilizan mediante una modificación del extremo 3 '. En conjunto, nuestros resultados indican que el silenciamiento de ARN en nuestro sistema no es activo contra el virus de Sindbis (SINV) y podría abrir el camino a una mejor comprensión de la respuesta antiviral mediada por una nueva clase de pequeños RNAs.

INTRODUCCIÓN

Con el fin de establecer con éxito una infección, los virus de participar en una carrera de armamentos continua con sus anfitriones, el resultado de que en última instancia podría resultar en la persistencia viral, el aclaramiento de la infección viral, o la muerte de las células infectadas. El arsenal de defensas antivirales y mecanismos de defensa contra virus es amplia y muy diversa entre los diferentes phyla de la vida. Las plantas, los insectos, nematodos y hongos en su mayoría (si no exclusivamente) se basan en una respuesta inmune innata, mientras que los mamíferos han evolucionado una respuesta de adaptación, además de esta primera línea de defensa. En los anteriores organismos, el componente antiviral de la respuesta inmune innata se basa principalmente en un proceso altamente conservada comúnmente conocido como silenciamiento de RNA, o la interferencia de ARN (ARNi). En este fenómeno, largos ARN de doble cadena de origen viral son escindidos por la RNasa Dicer en pequeños RNAs de interferencia (siRNAs), que luego se ensamblan en complejos efectoras que contienen un miembro de la (atrás) de la familia Argonaute; esto resulta en la degradación específica de mensajero viral o ARN genómicos ( 1 ).
En los mamíferos, otro tipo de inmunidad innata ha evolucionado para controlar los virus (2 ). El reconocimiento inicial de ácidos nucleicos virales nonself por sensores extra e intracelular desencadena la activación de tipo I interferones (IFN) ( 3 ). Esto conduce a su vez a la regulación al alza de numerosos genes de IFN-estimulado (ISGs) ( 4 ), que, o bien directamente desencadenar una cascada de señalización dirigido contra la infección viral o movilizar a otras células del sistema inmune. ISGs codifican proteínas implicadas en la inducción de la apoptosis, el bloqueo de la síntesis de proteínas, o en la regulación de edición del ARNm o la degradación del ARN ( 5 ). Uno de los factores clave que participan en la defensa del huésped IFN tipo I mediada por la RNasa L es, una endorribonucleasa citoplásmica latente que se activa por 2 ', 5'-oligoadenilatos en respuesta a ARN de doble cadena (dsRNA) de detección y que escinde ambos ARN víricos y celulares ( 6 ).
Aunque se han realizado extensos análisis de secuenciación de profundidad para identificar siRNAs en células de mamíferos infectados con varios virus de ARN, no hay hasta ahora ninguna buena evidencia de un posible papel antiviral del ARNi en células somáticas de mamíferos ( 7 ). Sin embargo, otra clase de pequeños RNAs no codificantes, microARN (miARN), se ha demostrado que desempeñan un papel importante durante la infección viral en mamíferos. miRNAs están conservadas evolutivamente pequeños RNAs derivados de grandes transcritos primarios, los cuales se procesan de forma secuencial por los respectivos nuclear y citoplasmática enzimas RNasa III, Drosha y Dicer, para generar madura de cadena sencilla ~ 21 - o 22 nucleótidos (nt) ARN ( 8 , 9 ). Similar a los siRNAs, que se incorporan en un efector Hace que contiene complejo de silenciamiento (RISC), por el que median la regulación postranscripcional de los ARNm diana a través de sitios parcialmente complementarios (inducida por ARN- 10 ). Por un lado, los miRNAs de origen celular pueden regular directa o indirectamente infecciones virales ( 11 , 12 ). Por otro lado, algunos virus han desarrollado la capacidad de codificar sus propios miRNAs, que representan una herramienta ideal para modular sigilosamente el entorno celular. Hasta la fecha, los miRNAs virales se han identificado casi exclusivamente en los genomas de los virus de ADN, en su mayoría herpesvirus ( 13 17 ), con la notable excepción de virus de la leucemia bovina, un retrovirus con un genoma de ARN ( 18 ). Se ha supuesto comúnmente que los virus de ARN citoplásmico no pueden codificar miRNAs, no sólo porque no tienen acceso a la maquinaria de la biogénesis nuclear, sino también porque su integridad genómica podría ser desestabilizado por procesamiento de miARN ( 19 ).Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la inserción de un miARN celulares precursor en el extremo 3 'región no traducida (NTR) de virus de Sindbis (SINV) ARN genómico conduce a su transformación citoplásmica sin afectar a la replicación viral ( 20 ,21 ).
El SINV artrópodos es una envoltura, virus ARN pequeño, positivo, de una sola cadena y es el prototipo del género alfavirus. Alfavirus representan un grupo de amplia distribución patógenos humanos y animales, que suponen una grave amenaza para la salud pública (22 ). Algunos de ellos inducen enfermedades febriles y artritogénicas, mientras que otros pueden causar enfermedades muy debilitantes, como la encefalitis. El ARN genómico SINV tiene un tope y polyadenylated y es infecciosa como ARN desnudo. A la entrada en el citoplasma por endocitosis, la maquinaria de traducción de acogida reconoce el ARN genómico y cuatro proteínas no estructurales se producen ( 23 ). Su expresión es suficiente para el establecimiento de los complejos de replicación y la síntesis de una cadena negativa de ARN antigenómico complementaria. El antigenoma es necesaria para la replicación del genoma viral y la producción de un ARN subgenómico que asegura la traducción de las proteínas estructurales durante la fase tardía de la infección ( 24 , 25 ).
Hasta la fecha, SINV no se ha demostrado para dar lugar a cualquier especie pequeñas de ARN en células de mamífero. Por lo tanto, decidimos investigar el perfil de ARN pequeño de líneas celulares de mono infectadas SINV humanos y africanas verdes.Usando pequeñas clonación ARN y técnicas de secuenciación de profundidad, aportar pruebas de que el genoma SINV es una fuente de pequeños RNAs en células de mamíferos infectados. Algunos de estos pequeños RNAs se acumulan a niveles detectados por análisis de transferencia de Northern. Nos pusimos en marcha para identificar los factores implicados en su biogénesis y muestran que no dependen de la maquinaria de silenciamiento de ARN, sino más bien, que son productos intermedios de la endoribonuclease inducida IFN-citoplasmática RNasa L. Por último, también presente en la evidencia experimental de que estos pequeños RNAs virales se modifican en su 'extremidad 3. En conjunto, nuestros resultados indican que los pequeños RNAs SINV derivados podrían constituir una guía clave del mecanismo de defensa del huésped.

RESULTADOS

Pequeños RNAs derivados de SINV acumulan en las células de mamíferos infectadas. Con el fin de investigar la presencia y naturaleza de los derivados de virus ARN pequeños en células de mamífero, se utilizó una pequeña clonación ARN y enfoque de secuenciación profunda. Hemos generado y analizado las pequeñas bibliotecas de ARN de ambos HEK293 y células Vero infectadas con SINV o no infectado con SINV.
ARN total fue aislado de las células no infectadas o células infectadas con SINV a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 unidades formadoras de placa (UFP) por célula 16 h después de la infección (hpi). Utilizando estas condiciones, se podría detectar células con una alta carga viral sin observar ninguna muerte celular aparente evaluada por tinción con yoduro de propidio (ver . Fig. S1 en el material complementario). También confirmó que hasta 24 hpi, las células se siguen proliferando activamente (datos no mostrados). Secuenciación de alto rendimiento produjo 201.793 y 1.193.893 lee que asigna a la SINV genoma en células HEK293 y Vero infectadas, respectivamente ( Fig. 1A. ); estos dos números de lecturas representado un porcentaje de 1,66 y 7,99%, respectivamente, del total asignada pequeños RNAs en células HEK293 y Vero. La mayor fracción de viral lee en células Vero es consistente con el hecho de que estas células son conocidos por ser más permisivas a las infecciones virales debido a un defecto en la producción de interferón ( 26 ). La distribución de la lee en las hebras virales genómicos (positivos) y antigenómico (negativos) se indica en la figura. 1A .Curiosamente, la gran mayoría de la lee (98 a 99%) se originan a partir de la hebra genómica del virus. Sin embargo, hemos identificado la secuencia limitada lee que se deriva de la cadena negativa, aunque a niveles extremadamente bajos en ambas bibliotecas ( . Fig. 1A ). Su distribución genómico mostró un pico en el extremo 3 'del antigenoma (ver . Fig. S2A en el material complementario). Esta región específica corresponde al promotor viral, necesaria para la replicación del genoma viral y se sabe que se pliegan en una estructura de tallo-bucle de 44-nt conservadas ( 25 ). La distribución de la longitud del pequeño ARN antigenómico lee alcanzó un máximo de un tamaño de 22 nt ( . Figura S2 B ), que corresponde al brazo 5 'de la estructura tallo-bucle ( . Figura S2C ). Aunque podríamos validar la presencia de los 44-nt-largo ARN mediante análisis de transferencia Northern, no hemos podido detectar la acumulación de la pequeña de 22 nt ARN como una especie discretos ( . Figura S2D ).
FIGURA 1 
Identificación de los pequeños RNAs derivados de SINV. (A) los pequeños ARN específico del virus lecturas fueron recuperados de cada biblioteca (células HEK293 infectadas con SINV [HEK293-SINV] y Vero-SINV) y fueron asignadas a ambos positivos (+) y negativo (-) hebras del genoma viral. (B) La distribución del tamaño de las poblaciones pequeñas de ARN derivados de SINV. La proporción de sRNAs virales que se derivaron de la cadena con sentido genómico en cada clase de tamaño se muestra como un porcentaje del total pequeño ARN viral lee para esta cadena. (C) Distribución de virus lee la cartografía a la SINV genómica capítulo. Se calculó la abundancia de ARN pequeños y se representó como la suma normalizada de lecturas (por 10 5 viral lee) en cada uno de un solo nucleótido ventana deslizante a lo largo del genoma viral. Las pequeñas flechas negras indican los picos seleccionados para la validación de transferencia Northern (véase. Fig. S1 en el material complementario). Un diagrama esquemático que representa la organización de SINV genoma. Los dos marcos de lectura abiertos (ORF), que codifican las no estructurales (NS) y proteínas estructurales, se muestran. La región no traducida (NTR) en el extremo 3 'del virus se muestra como una pequeña barra de color negro. (D) la validación de transferencia de Northern de candidatos SINV. ARN total fue aislado en los puntos de tiempo indicados a partir de células HEK293 infectadas con SINV a una MOI de 0,01. Células no infectadas (-) se utilizaron como control negativo. U6 snRNA se utilizó como control de carga. (E) La cuantificación del genoma SINV durante la infección por transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR). La cuantificación relativa se normaliza a la gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) niveles de deshidrogenasa y se representa en una escala logarítmica como una media de tres repeticiones. NI, no infectados.
La distribución del tamaño de la población principal de la viral lee mapeo de la cadena positiva del virus era amplia con ningún pico definido en una longitud específica ( . Fig. 1B ). Sin embargo, una inspección más cercana reveló que el tamaño total y la distribución genómica de la viral lee eran muy similares tanto en células HEK293 y células Vero ( . Fig. 1C ). Por otra parte, se encontró un mayor número de lecturas entre los nucleótidos 7000 y 11700 del genoma viral, que corresponde a la ARN subgenómico abundantemente expresado.
Se seleccionaron 14 candidatos entre los picos más abundantes obtenidos en ambos tipos de células para la validación por análisis de transferencia Northern (ver . Fig. S3Aen el material complementario). Hemos podido detectar varias SINV derivados virales pequeños RNAs (SvsRNAs) de 20 a 30 nt de longitud que se deriva de todo a lo largo del genoma viral ( . Figura S3 B ). Entre ellos, se detectaron SvsRNA-1, -2, y -3 en tanto HEK293 y células Vero ( . Fig. s3c ). La presencia de abundantes bandas más grandes que se acumulan entre 40 y 100 nt también se puso de manifiesto. De nota, la expresión de ambos ARN virales más grandes y más pequeñas aumenta proporcionalmente a la acumulación del genoma viral durante un curso de tiempo de la infección ( Fig.. 1D y E ).La identificación de los pequeños RNAs derivados de SINV nos llevó a analizar más de cerca su origen y propiedades bioquímicas.
La producción de SvsRNAs no se basa en la maquinaria de la biogénesis miARN.La identificación de pequeños RNAs de virus de ARN podría ser visto ya sea como resultado de un mecanismo productivo para el patógeno (como para miRNAs codificada por el virus) o como la consecuencia de un host respuesta al control de la infección mediante la degradación de los ARN virales. SINV expresa cuatro enzimas que desempeñan funciones clave en el ciclo de replicación viral. Sin embargo, ninguna de estas enzimas es conocida por poseer una actividad endorribonucleasa ( 22 ) que podría permitir el procesamiento de pequeños RNAs de un precursor de ARN viral. Por lo tanto, las enzimas celulares tienen que estar involucrados en la biogénesis de SINV sRNAs.Para identificarlos, se decidió derribar enzimas citoplasmáticos con una actividad RNasa conocido. En primer lugar, se centró en las proteínas importantes para la producción de ARN pequeños, como miRNAs. Por lo tanto, transfectadas siRNAs contra Drosha, Dicer, o Ago2 seguido por una infección con SINV y un análisis de pequeña acumulación de ARN viral. Aunque Drosha se sabe que es sobre todo nuclear, también tomamos en consideración porque se demostró recientemente para relocalizar al citoplasma tras la infección SINV ( 21 ). Aunque hemos sido capaces de regular a la baja de manera muy eficiente Drosha, Dicer, y Ago2 (ver la fig. S4A a C en el material complementario), la caída de estos factores no afectó a la carga viral ni la acumulación de SvsRNA-1, -2 y -3 ( . Fig. s4d a G ). También se examinó si pudiéramos detectar una firma siRNA entre todos viral lee mediante la búsqueda de los pequeños RNAs que podría par de bases perfectamente en 19 o 20 nt y presentar un voladizo 2-nt en 3 '. Un número muy limitado de tales dúplex se pudo encontrar, pero no fueron más representada que dúplex más grandes que presentan 3 'o 5' salientes (datos no mostrados). Se ha informado de que los pequeños ARNs, que no se generan por Dicer o Drosha de escisión, sin embargo, podrían ser ensamblados en Argonaute proteínas (por ejemplo, fragmentos de ARNt [ 27]). Por lo tanto, immunoprecipitated proteínas Argonaute seguido por análisis de transferencia Northern para ver si SvsRNAs podrían ser detectados dentro del RISC. Sin embargo, aunque se podría detectar la acumulación del celular miARN miR-16, utilizando tanto un anticuerpo específico para Ago2 ( Fig. S4H , panel izquierdo) y un anticuerpo capaz de reconocer las cuatro proteínas Hace ( . Fig. S4H , panel derecho), hemos podido detectar SvsRNAs dentro inmunoprecipitada RISC.
RNasa L está implicada en la producción de SvsRNAs. Nosotros entonces la hipótesis de que una endorribonucleasa que participan en la respuesta antiviral podría estar implicado en la producción de SvsRNA. RNasa L es una endonucleasa de ubicua, citoplasmática, inducida por interferón-que juega un papel clave en la respuesta celular a las infecciones virales. Se escinde de una sola cadena regiones de ARN después de los dinucleótidos UA / UU, impidiendo de este modo la acumulación de virus ( 28 ). Como tal, hemos derribado RNasa L utilizando siRNAs, antes de infectar las células con SINV.Como era de esperar, la RNasa L desmontables (KD) resultó en la regulación positiva del genoma SINV en aproximadamente 2,5 veces ( . Fig. 2A y B ). Curiosamente, también resultó en una reducción dramática de la pequeña ARN viral SvsRNA-1, -2, y -3 y sus precursores ( 2C. Fig. ).
LA FIGURA 2 
Efectos de la RNasa L y XRN1 caída en la acumulación de SvsRNA. (A y D) de RNasa L y XRN1 caída en células HEK293 infectadas por el SINV se verificó por transferencia de Western.Tubulina (hidromasaje) se utilizó como un normalizador. sictrl, controlar siRNA; siRNaseL, RNasa L siRNA; siXrn1, XRN1-siRNA. (B y E) SINV ARN genómico se cuantificó por RT-qPCR, antes y después de la RNasa L o XRN1 KD. La cuantificación relativa se normaliza a los niveles de GAPDH y se representa en una escala logarítmica como una media de tres repeticiones. (C y F) Análisis de transferencia Northern de ARN total de las células HEK293 infectadas antes y después de la RNasa L o XRN1 KD. U6 se utilizó como un normalizador.
Con el fin de ampliar esta observación y evaluar el papel de la RNasa L en la generación de SvsRNA, que también produjo pequeñas bibliotecas de ARN a partir de células HEK293 tratados con un control o una RNasa-L siRNA antes de la infección SINV. En conformidad con el efecto llamativo visto en los tres SvsRNAs específicos, la reducción en el nivel de proteína RNasa L disminuyó toda la población de secuencias virales clonables 2,75-1,19% (ver . Fig. S5 en el material complementario). Sin embargo, la RNasa L caída afectó ni la distribución del tamaño de viral lee ni su distribución genómica ( . Fig. S5B y C ).
Dadas las propiedades de escisión de la RNasa L (véase la sección siguiente), era poco probable que los pequeños RNAs identificados fueron producto directo de esta enzima.Por lo tanto, buscamos otros factores implicados en la degradación del ARN que podrían afectar a la acumulación SvsRNA. Se utilizó RNAi para regular a la baja la expresión de la principal citoplásmica 5'-3 'exoribonuclease XRN1 ( Fig.. 2D ). Como era de esperar, el genoma viral cubiertas no se vio afectada por regulación a la baja de XRN1 ( . Fig. 2E ).Sin embargo, los niveles de SvsRNA-1, -2, y -3 y sus precursores se estabilizaron ( . Fig. 2F ). A continuación, analizamos el efecto de la combinación de caída de estos factores (ver . Fig. S6 en el material complementario). Se encontró que el doble desmontables de tanto RNasa L y Dicer no afectó la acumulación de SvsRNA-1 en comparación con la única RNasa L de caída, lo que confirma que Dicer no juega un papel ( . Fig. S6A ). Por el contrario, la acumulación de SvsRNA-1 sobre doble caída tanto de la RNasa L y XRN1 aumentó en comparación con la única RNasa L desmontables ( . Fig. S6A ). Este hallazgo sugiere que tanto la RNasa L y XRN1 pueden actuar sobre RNAs virales y tienen actividades opuestas en términos de generación y la estabilización de los SvsRNAs. XRN1 podría actuar aguas arriba de la RNasa L en degradantes, por ejemplo, los ARN virales debutantes que de otro modo sería un substrato para la RNasa L, alternativamente, podría actuar directamente sobre los productos de ARNasa L. La primera hipótesis es más probable, sin embargo, porque XRN1 tiene preferencia por 5 'fosforilados ARN, mientras que la RNasa L deja un 5' OH después de la escisión.También se realizó un análisis de transferencia de Northern de alto peso molecular para analizar los efectos de las diversas caídas sobre la acumulación de los ARN virales genómicos y subgenómicos. Los resultados confirman los datos cuantitativos de PCR, en que sólo la RNasa L KD tiene un impacto en la acumulación de ambos ARNs genómicos y subgenómicos ( . Fig. S6B ).
También probamos varios exoribonucleases citoplasmáticos 3'-5 ', incluyendo DIS3L, DIS3L2, y Rrp40 (también conocido como EXOSC3, una subunidad central de la exosoma); desmontables de estos factores no tuvo ningún efecto sobre la acumulación de SvsRNA (datos no mostrados). Esto indica que, al menos, los principales exoribonucleases citoplasmáticos 3'-5 'no parecen estar implicados en la producción de los pequeños RNAs virales.
El extremo 3 'de SvsRNA-1 se modifica. procesamiento de ARNasa L produce una firma típica: la enzima deja un 5 'hidroxilo (OH) y un fosfato 3 (P) después de la escisión (6 ). Sin embargo, estas características no son compatibles con el protocolo de clonación pequeño ARN ( 29 ), que se basa estrictamente en la presencia de un 5 'P y un 3' OH en las pequeñas extremidades de ARN. Esto nos llevó a caracterizar las extremidades de SvsRNAs para entender mejor su biogénesis. Inicialmente se decidió restringir el análisis a SvsRNA-1, ya que acumula como una forma importante de 23 nt. El ensayo utilizado para el análisis de ARN 5 'termina la digestión involucrado con la exonucleasa Terminator, un 5'-3 processive' exonucleasa que ataca y degrada ARN con un 5 específicamente 'monofosfato, pero no con los ARN 5' trifosfato, 5 'OH, o CAP a 5 '( 30 ).
Para un control, la reacción Terminator se llevó a cabo tanto en un 5 'OH y un 5' oligorribonucleótido P con la misma secuencia que SvsRNA-1. Terminator tratamiento no dio lugar a la degradación de la 5 'OH oligorribonucleótido sintético, mientras que el 5' P oligonucleótido de ARN era casi completamente degradada. En consecuencia, SvsRNA-1 es propenso a la degradación por la exonucleasa Terminator, que es consistente con la presencia de un monofosfato en el extremo 5 ', mientras que la acumulación de las bandas precursoras fue menos afectada por el tratamiento ( Fig.. 3A ).
LA FIGURA 3 
Caracterización de 5 'y 3' de las extremidades SvsRNA-1. (A) Los oligonucleótidos sintéticos que tienen 5 'OH o 5' P termina o ARN total se trataron con exonucleasa Terminator (+) o no tratados con Terminator (-) antes de ser analizados por transferencia de Northern. (B) β-eliminación de ARN total HEK293-SINV seguido por transferencia de Northern de SvsRNA-1 y MIR-16 después de la migración en el 17,5% en gel de poliacrilamida. Los asteriscos indican precursores putativos de SvsRNA-1. (C) SvsRNA-1 moléculas sintéticas que tienen 3 'P, 3' OH, o 3 'OH 2'-O-Me extremos se trataron con fosfatasa intestinal de ternero (CIP) (carriles 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16). Desfosforilación fue seguido por β-eliminación (carriles 4, 8, 12, y 16). oligo, oligonucleótido; mí, metilo; elim, eliminación.
A continuación, se realizó un peryodato de sodio (NaIO 4 ) tratamiento seguido de β-eliminación para examinar específicamente el extremo 3 'de SvsRNA-1. Se necesita la presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 2 'y 3' en la última ribosa para la reacción de peryodato. β-eliminación de los resultados de ARN oxidados en un producto de ARN uno o dos nucleótidos más corto. Por el contrario, la presencia de modificaciones en la ribosa del residuo terminal 3 'hace que el ARN insensible a la oxidación con peryodato y perjudica la escisión de la cadena ( 31 ). Para un control de la reacción, se midió su efecto sobre la no modificada celular miARN miR-16. Como era de esperar, la movilidad electroforética de los genes miARN cambió fuertemente después del tratamiento ( . Fig. 3B ). En contraste, SvsRNA-1 movilidad se encontró que era insensible a la oxidación con peryodato y β-eliminación ( . Fig. 3B ). Esto indicaba la presencia de una modificación en la ribosa terminal, muy probablemente en la posición 2 ', que es perfectamente compatible con el protocolo de clonación. Curiosamente, parece también que los productos de ARN intermedios son insensibles a la oxidación con peryodato y en consecuencia se modifican (ver . Figura S7 en el material complementario). Por otra parte, también hemos sido capaces de evaluar la existencia de un extremo 3 'modificado para otros SvsRNAs por Northern Blot ( . Fig. S8 ).
Con el fin de obtener más información sobre la naturaleza de esta modificación, se trataron las muestras con fosfatasa intestinal de ternero (CIP) ( . Fig. 3C , carriles 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16) antes de la β -eliminación ( . Fig. 3C , carriles 4, 8, 12, y 16). El doble tratamiento afectó fuertemente la movilidad de un oligorribonucleótido de control con un 3 'P ( . Fig. 3C , carril 4), mientras que la movilidad de la 3 'OH oligonucleótido se vio afectada de forma independiente del tratamiento CIP ( . Fig. 3C , carriles 7 y 8 ). De nota, las reacciones combinadas cambian ni la movilidad de un oligorribonucleótido de control que lleva una modificación CIP-insensible (grupo metilo en la posición 2 'de la última ribosa) ( Fig.. 3C , carril 12) ni la movilidad de SvsRNA-1 ( Fig.. 3C , carril 16).
Tomados en conjunto, estos resultados muestran que SvsRNA-1 se modifica en su 'extremidad 3 pero que la modificación no se debe a un grupo monofosfato causada por una RNasa L de corte directo.
ARN genómico viral es modificado en un 8333 . La presencia de las modificaciones postranscripcionales, tales como 2'- O -metilación, es una característica de varios ARNs celulares en mamíferos, tales como ARNr ( 32 ), ARNsn ( 33 ), y de pío-interactuar ARN (piRNAs) ( 34 , 35 ). Recientemente, también se ha informado de varios virus que su ARN genómico puede ser 2'- O -metilado en posiciones específicas ( 36 , 37 ). La hipótesis de que la modificación en el pequeño ARN podría ser derivado de una modificación en el nivel del ARN genómico, que es razonable teniendo en cuenta el hecho de que SvsRNA-1 ARN precursores también parecen estar modificado (ver . Fig. S7 en el material complementario) . Así Buscamos modificaciones en la región genómica que abarca SvsRNA-1 utilizando la RTL-P ( r everse t ranscription en l ow concentraciones trifosfato desoxirribonucleósidos seguido de p reacción en cadena de olymerase) Técnica ( 38 ): la tendencia de la transcriptasa inversa para detener inmediatamente antes de un 2'- O se explota nucleótido metilado para establecer la eficacia de la retrotranscripción por PCR semicuantitativa, usando las concentraciones de trifosfato de desoxinucleósido diferencial (dNTP).
Como se muestra en la figura. 4A , se diseñó un cebador inverso de la transcripción específica para el genoma viral, así como cebadores para la PCR semicuantitativo en la región que rodea SvsRNA-1 (se muestra en rojo): un cebador inverso (R) y tres cebadores directos, aguas arriba (F U ) o aguas abajo de la modificación putativo (F D1 y F D2 ). Después de retrotranscripción con bajas y altas concentraciones de dNTP, se realizó PCR multiplex usando los cebadores F U / F D1 (en la región SvsRNA-1) o cebadores F D1 / F D2 (en la región de control) y luego compararon los ratios de intensidad de señal de PCR productos amplificados con diferentes números de ciclos de PCR ( . Fig. 4B ). Nuestros datos indican que sólo el F U / F D1 proporción cambió dependiendo de las condiciones de RT ( Fig.. 4B , panel superior), lo que sugiere que a una baja concentración de dNTP, la transcriptasa inversa se ​​detuvo en la región SvsRNA-1, muy probablemente debido a la presencia de una modificación en el genoma viral en la región de interés.
LA FIGURA 4 
ARN genómico SINV se modifica.(A) Representación esquemática del diseño de la cartilla para la RTL-P para detectar la presencia de 2'- O nucleótidos metilados (m) en el genoma viral. SvsRNA-1 se indica en rojo. (B) Detección de la metilación por RTL-P bajo las dos concentraciones de dNTP de alta y baja y los ciclos de PCR en las células HEK293 infectadas por el SINV. La relación de intensidad de la señal de PCR se indica debajo de cada carril. (C) la cartografía extensión del cebador de 2'- O -metilado nucleótidos. Los carriles de U, G, C, y A representan las reacciones de secuenciación didesoxi realizadas en el in vitro transcripción amplificada para la misma región viral. Los asteriscos indican las paradas de la transcriptasa inversa.
Para reforzar aún más esta observación e identificar la posición exacta de la modificación de nucleótidos, hemos realizado ensayos de extensión del cebador en ARN aislado de cualquiera HEK293 infectadas por el SINV o células Vero ( . Fig. 4C ). 2'- O -metilación puede causar la transcriptasa inversa para hacer una pausa en un nucleótido antes y / o en el O -nucleótido metilado. De hecho, se identificaron dos bandas (RT paradas) que corresponden a los nucleótidos T 8334 y A 8333 , este último correspondan exactamente con el extremo 3 'de la secuencia SvsRNA-1 ( . Fig. 4C ).
Estos datos implican que la modificación del extremo 3 'de SvsRNA-1 era probable ya presente en el genoma viral y puede ser un 2'- O -metilación.
Modificación extremo 3 'es un sello de SvsRNAs. Tomados en conjunto, nuestras observaciones indican que la SINV ARN genómico se modifica, por lo que son sugestivos de una posible modificación de SvsRNAs. Entonces nos decidimos a investigar en qué medida se lee la cartografía al genoma SINV fueron modificados en la última posición de nucleótidos. Bibliotecas de ARN pequeños se prepararon a partir de células HEK293 no infectados o infectados con SINV utilizando ARN total tratado (o no) con NaIO 4 . Este tratamiento afecta específicamente la 3 'adaptador de ligadura a las especies de ARN no modificadas con 3' extremos (2 'y 3' OH), mientras que los ARN que llevan una modificación en una de estas posiciones son resistentes a la oxidación, y por lo tanto se puede ligar. Durante la noche la ligadura de adaptador de la 3 'a 16 ° C se realizó con el fin de mejorar la clonación de 2'- O modificada pequeños RNAs ( 39 ).
Después de secuenciación profunda de estas bibliotecas, estudiamos el número total de lecturas tanto contra la SINV genoma (humano y de la Tabla 1 ). Como era de esperar, tanto en las células no infectadas e infectadas, la NaIO 4 tratamiento redujo drásticamente el número de secuencias de genes miARN clonables (véase también . Fig. S9A en el material complementario). En contraste, pequeños RNAs modificados (tales como fragmentos de ARNt) se clonaron preferentemente sobre miRNAs sobre NaIO 4 de tratamiento ( . Fig. S9B ). Sorprendentemente, casi 75% de la viral lee se mantuvieron después de la oxidación ( Tabla 1 ). El tratamiento de oxidación no cambió drásticamente la distribución genómica de la viral lee en comparación con la muestra no tratada ( Fig.. 5A ). Sin embargo, la secuenciación profunda reveló algunos picos nuevos ( Fig. 5A. , flechas) que también podríamos validar por β-eliminación y del Norte blot (ver SvsRNA-15 y -16 en . Fig. S8 ).
CUADRO 1
Resultados de la secuenciación profunda de Nalo 4 -tratadas y pequeños ARN no tratado bibliotecas un
LA FIGURA 5 
Secuenciación profunda tras la oxidación con peryodato en células HEK293 infectadas por el SINV. (A) Distribución de virus lee la cartografía al genoma SINV. Se calculó la abundancia de ARN pequeños y se representó como la suma normalizada de lecturas (por 10 5 viral lee) en cada uno de un solo nucleótido ventana deslizante a lo largo del ARN SINV. Las pequeñas flechas negras indican los picos seleccionados para la validación de transferencia de Northern. (B) La distribución del tamaño de las poblaciones pequeñas de ARN derivados de SINV. El porcentaje de sRNAs virales derivados de la cadena de sentido genómico en cada clase de tamaño se muestra como un porcentaje del total pequeño ARN viral lee para esta cadena. Los datos de los infectados por el SINV muestras de células HEK293 tratados con NaIO 4 o no tratados con NaIO 4 se muestran (NT). (C) relativa frecuencia de nucleótidos en cada posición. El viral lee con 0 desajuste a la cadena SINV positivo fueron considerados para este análisis. Sólo se muestran los últimos cinco nucleótidos del extremo 3 'de cada secuencia.
La distribución del tamaño de la lecturas viral se mantuvo sin cambios antes y después NaIO 4 del tratamiento, lo que indica que los ARN modificados derivados de SINV pertenecían a cada longitud ( . Fig. 5B ). Finalmente, se analizó la composición de nucleótidos del extremo 3 'de SINV pequeños RNAs y observó que tuvimos en el enriquecimiento de adenosina (A) en el extremo 3' después de la oxidación, que no fue claramente discernible en la muestra sin tratar ( Fig.. 5C ). Esto está en línea con la 2'-específica O -metilación que ocurren en adenosinas internos recientemente identificados en el genoma del virus de dengue ( 36 ).

DISCUSIÓN

Mamíferos han desarrollado una respuesta inmune innata muy sofisticada para protegerse de patógenos que se basa en la detección de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) por los receptores de reconocimiento de patrones dedicados (PRRS). Cuando se trata de la infección viral, una de las más potentes PAMP es dsRNA. El reconocimiento de dsRNA por PRRS desencadena una cascada de señalización que conduce finalmente a la activación de los genes sensibles al interferón (ISGs) ( 40 ). Silenciamiento de ARN es otro tipo de inmunidad innata antiviral, el cual, a partir de ahora, la mayoría se ha demostrado en los organismos de plantas e insectos ( 1). No obstante, un papel para el silenciamiento de ARN como un sistema de defensa del huésped contra virus de mamíferos podría razonablemente ser considerada. De hecho, Dicer, la enzima clave para dsRNA de escisión se conserva en los vertebrados superiores, y aunque su principal sustrato in vivo es moléculas de pre-miARN, que es capaz de procesar largo dsRNA en ARN cortas in vitro ( 41 ). Sin embargo, la cuestión de qué otros tipos de moléculas de ARN de doble cadena de mamíferos Dicer puede escindir in vivo ha sido el tema de una intensa investigación, y especialmente cuando se considera RNAs de origen viral. En este caso, hemos querido hacer nuestra contribución en el campo de estudio de la arbovirus prototípico, virus Sindbis. Este tipo de virus puede infectar tanto a los insectos y mamíferos, y como tal es una herramienta útil para estudiar la conservación de los mecanismos antivirales en ambos filos. Curiosamente, se ha demostrado para algunos miembros del género alfavirus que su ARN genómico se puede procesar en ambos siRNAs y piRNAs en las células somáticas de insectos ( 42 , 43 ).
En este estudio, hemos generado las pequeñas bibliotecas de ARN a partir de dos diferentes líneas celulares de mamíferos infectados con SINV. Aunque el porcentaje de asignación de secuencias al genoma viral fue significativa (~ 1,7 y ~ 8% en las células HEK293 y Vero, respectivamente), que fueron incapaces de detectar tanto siRNA o firmas Pirna. Por el contrario, el virus lee muestra una distribución altamente sesgada hebra. Aunque antigenómicos secuencias de cadena derivados (negativos) representan un porcentaje muy pequeño del total de virus lee, mostraron propiedades distintas de la genómica hebra (positivo) lee: su distribución de tamaño alcanzó un máximo de 22 nt, y su localización en el genoma viral se restringe a los promotores requeridos para la síntesis de tanto el ARN genómico y subgenómico. Aunque las secuencias clonadas 22-nt no eran visibles por análisis de transferencia Northern, hemos podido detectar la acumulación de un producto de ~ 44 nt que en nuestro conocimiento nunca ha sido observado antes. Se postula que estas especies de ARN podrían ser críticos para la replicación viral, de manera similar a lo que se ha informado anteriormente para el virus de la influenza ( 44 ).
En consonancia con la abundancia relativa de la cadena positiva en comparación con la cadena negativa, la mayoría de lecturas se obtuvieron a partir del ARN de cadena positiva y más específicamente de la región correspondiente a la secuencia de ARN subgenómico. Hemos podido detectar varios puntos calientes de la acumulación de ARN pequeño, lo que indica que las pequeñas especies de ARN virales SINV derivados discretos (SvsRNAs) podrían ser producidos en células de mamíferos infectados. Estos SvsRNAs no muestran ningún pico en la distribución de tamaño y no se asignan a ninguna región alfavirales conservado. Sin embargo, nos dimos cuenta de que tienen su origen en las mismas posiciones genómicas víricas en tanto mono verde africano infectadas y células humanas. Con el fin de confirmar que esto no se debió únicamente a un sesgo en la pequeña protocolo de clonación de ARN, se realizó un análisis de transferencia de Northern de varios candidatos de ARN pequeños. Para algunos de los candidatos, hemos sido capaces de detectar bandas discretas, que aumentaron en intensidad a lo largo del curso del tiempo de la infección.
Por lo tanto, se centró en la caracterización de las hebras derivados positivos pequeños RNAs. Una de las hipótesis con respecto a su identidad podría ser que algunos de estos se encuentran en SvsRNAs miRNAs codificadas por el virus de hechos. El uso de herramientas bioinformáticas como miRDeep2 ( 45 , 46 ) y miRanalyzer2 ( 47 , 48 ), se excluyó la posibilidad de que las estructuras precursoras putativo miARN estaban presentes en el genoma viral. Sin embargo, hemos probado si la maquinaria miRNA se requiere para la producción de los pequeños RNAs virales derribando Drosha, Dicer, y Ago2. La regulación a la baja de estos factores afectaron ni la replicación SINV ni acumulación de los tres más abundantes SvsRNAs identificados, lo que indica que su producción debe incluir otro RNasa. Descubrimos que la endonucleasa RNasa L está implicado en SvsRNA génesis. De hecho, su regulación a la baja causa una reducción dramática en la acumulación de Sindbis pequeños RNAs virales detectados por análisis de transferencia Northern, lo que va acompañado de una regulación positiva de la ARN genómico viral. Con el fin de extender esta observación, también generamos pequeñas bibliotecas de ARN a partir de células HEK293 tratados con siRNAs contra RNasa L y se infectaron con SINV. Hemos encontrado que, en estas condiciones, se downregulated la población mundial de SINV sRNAs. RNasa L es una endorribonucleasa que está presente en la célula en forma de un monómero inactivo. Tras la inducción de interferón de tipo I, y más específicamente la activación de la sintetasa oligoadenilato 2'-5 '( 6 ), se puede dimerizar y luego actuar sobre sus objetivos de ARN virales. RNasa L se sabe que juega un papel antiviral contra el virus, como el virus del Nilo Occidental ( 49 ), el virus de la hepatitis C ( 50 ), y SINV ( 51 ). También nos fijamos en la participación de exoribonucleases en la producción de SvsRNAs y encontramos que, en efecto, la acumulación de estos pequeños RNAs es contrarrestado por la exonucleasa celular 5'-3 'XRN1. Esto sugiere que SvsRNAs representan productos virales estables de enzimas de desintegración celulares. Por lo tanto, la hipótesis de que la RNasa L es la enzima implicada principalmente en la generación de pequeños RNAs y que el tratamiento posterior operado por otras enzimas no caracterizados podría dar lugar a la final de 20 - a 30-nt largo RNAs virales. También sigue siendo posible que algunos de los fragmentos que detectamos son productos directos de la RNasa L, pero se modifican adicionalmente por quinasas y dephosphorylases, lo que permitiría su clonación.
El hecho de que fragmentos de ARN generados por la RNasa L se detectan implica que algunos de ellos debe ser estabilizado. De hecho, hemos descubierto que los virus de ARN pequeños candidatos parecen ser modificada en el nucleótido próximo a 3 '.Podríamos extender esta peculiaridad de la población mundial de ARN pequeño de la clonación y secuenciación de ARN pequeños después de un tratamiento de oxidación diseñado para prevenir la ligadura de ARN no modificado. Nuestros datos indican que esta modificación es más probable un 2'- O -metilación y parece ocurrir en el nivel del ARN genómico viral, preferentemente en adenosinas. Gracias a un doble enfoque de RTL-P y la extensión del cebador, que fueron capaces de cartografiar tal modificación en la posición A 8333 del genoma viral SINV. Además, nuestros datos de secuenciación indican que hay más probable muchos otros dado el enriquecimiento en A residuos en el extremo 3 'de ARN pequeños clonados después del tratamiento oxidativo.
El principal mecanismo de protección contra 3'-5 'degradación es un 2'- O -metilación en la ribosa 3 'proximal, lo que impide la degradación por exoribonucleases y por lo tanto ayuda a estabilizar ARN pequeños tales como miRNAs y siRNAs en las plantas, piRNAs en animales, y siRNAs en Drosophila melanogaster ( 52 ). Esto sugiere que la modificación de ARN podría haber evolucionado como una respuesta para proteger a los anti-patógenos pequeños RNAs durante las infecciones. Modificaciones de ARN posttranscriptional representan un importante, pero aún no se entiende completamente el sistema para regular las transcripciones. RNAs celulares contienen muchas modificaciones postranscripcionales distintas en miles de sitios. De la misma manera, los virus de ARN se aprovechan de modificaciones de nucleósidos en la base o en la ribosa de su ARN genómico ( 36 , 53 ) como una estrategia de imitación del hospedador a derogar la señalización inmune innata ( 54 ).
La enzima responsable de la metilación de SINV ARN sigue siendo desconocido. Sin embargo, se ha informado de que la proteína de alfavirus de nsP2 contiene un putativo metiltransferasa (MT)-como dominio, similar a virus del dengue NS5 MTase ( 55 ). Si bien la actividad de este dominio no se ha verificado aún, nsP2-MTase virus mutantes exhiben un fuerte fenotipo: negativo-capítulo de síntesis es continua, y se producen complejos de replicación viral inestables. Sorprendentemente, las células-L deficiente RNasa infectadas con SINV muestran el mismo fenotipo, lo que sugiere que las dos proteínas funcionan en eventos similares ( 55 ). Por todas estas razones, proponemos que la RNasa L-dependiente, pequeños RNAs 3 'modificados de SINV podría participar como intermediarios en este mecanismo.
En conjunto, nuestros resultados muestran una relación entre la vía de degradación de acogida y la estabilización de los pequeños RNAs virales modificados. Claramente, no todos los pequeños RNAs identificados por nuestro enfoque de secuenciación profunda corresponden a la RNasa L productos aguas abajo. No obstante, el hecho de que al menos algunos de estos pequeños RNAs están protegidos y se detectaron podría implicar a ellos en los eventos de señalización, tal vez aguas arriba de la parte delantera de la infección, lo que podría resultar difícil de evaluar en cultivo celular. La hipótesis de que mediante la eliminación de la RNasa L podríamos descubrir firmas que corresponden a otros tipos de ARN pequeños, como siRNAs o piRNAs, pero no resultó ser el caso.Esto podría ser debido al hecho de que otras enzimas también podrían estar involucrados en la producción de fragmentos de ARN y es una indicación de que va a hacer la detección de RNAi complicado antiviral en células de mamífero diferenciadas.Una hipótesis alternativa también podría ser que SINV codifica un supresor de silenciamiento de ARN que bloquea la actividad de Dicer, pero no tiene efecto sobre la RNasa L. Finalmente, también es posible que la respuesta antiviral de RNAi puede ser detectado sólo en subtipos específicos de células en mamíferos, que haría ser diferentes de las células somáticas diferenciadas que utilizamos para nuestro estudio. Se requiere más investigación para responder a estas preguntas y descifrar las funciones desempeñadas por este tipo de derivados de virus ARN pequeños, así como su potencial implicación en el diseño de nuevas estrategias terapéuticas antivirales.