lunes, 24 de marzo de 2014

El riesgo de una picadura de garrapata prevalece en gran parte de Alemania ahora ronda casi todo el año. Se confirman las primeras infecciones de TBE en el año. Cómo alarmante son?

Peligrosas de recuerdo: Los expertos advierten de las garrapatas en Austriaes riesgoso subestimar las garrapatas. Pero este invierno ha hecho algo bastante raro sucede: su hibernación, lo que suele ocurrir cuando las temperaturas entre noviembre y finales de febrero durante un tiempo por debajo de siete grados caídas y mantiene las arañas debajo del follaje húmedo, esta vez los ojos se mantuvieron en muchas partes del país. El resultado: Ixodes ricinus, la garrapata de la madera congregación, había permanecido activa y al acecho de sus anfitriones en el césped. En invierno, hace ocho años, que fue jamás observado. En las estaciones de garrapatas que son operados por el Berlín científicos Olaf Kahl por el campo, las actividades se habían identificado de manera consistente. El invierno cayó.Así que fue en esta ocasión también.Y el resultado ya es leído en las estadísticas de enfermedades del Instituto Robert Koch, tales como el neurólogo Frankfurter Ute Meyding-Lamadé ha sido identificado por Northwest Hospital poco antes del inicio de la segunda Süddeutsche garrapatas Congreso en la Universidad de Hohenheim: Por primera vez ya en los dos primeros meses del año, cinco casos han sido documentados de infecciones TBE. La garrapata, los portadores más peligrosas de la enfermedad a los seres humanos, aparentemente más activo - y más amenazante.
Más de cincuenta patógenos diferentes pueden ser transmitidos por las garrapatas en todo el mundo. Los patógenos más importantes en este país son las bacterias que causan la enfermedad de Lyme y son responsables de 100.000 enfermedades en el país. La infección se puede tratar con Antbiotikum. Sin embargo, temía que, al menos, ya que el virus que la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), una forma especial de meningitis provoca. Siete a catorce días después de la picadura de la garrapata, se inicia con los dolores de cabeza y cuerpo y la gripe con fiebre. Una parte considerable sufre en el segundo episodio, cuando el cerebro y la médula espinal son afectados con mayor frecuencia en los trastornos del habla, trastornos de la conciencia, parálisis o convulsiones. En el uno por ciento de las infecciones, el curso será fatal.

TBE se puede prevenir por vacunación cuando se actualiza regularmente. El riesgo TBE puede ahora a menudo en los meses de invierno no después. "Hace dos años, el número de casos con 195 casos parecía declinar", dice Ute Mackenstedt de la Universidad de Hohenheim. 2013 es el número de infecciones documentadas, sin embargo, aumentó de nuevo a 420. Eso era casi tanto como 2011und 2006. A pesar de las enormes fluctuaciones de corto plazo que se explican principalmente de la climatología y de la población fluctuaciones, existe una clara tendencia a largo plazo: Durante años, la TBE está en constante crecimiento. Aumenta el número de zonas de riesgo. Las temperaturas más suaves medios aseguran que el cargado de virus garrapatas son secuestrados extendió cada vez más al norte o. Incluso en los países escandinavos, hay infecciones. En las zonas alemán riesgo, que siguen siendo en gran medida están en Baviera y Baden-Württemberg, la probabilidad de infección TBE es después de una picadura de garrapata en 1 y 50 a 1: 100 Usted puede informar en detalle en un sitio web contendrá los mapas y regularmente actualizado con la información científica más reciente y las actualizaciones. Desde el año 2001 el número de condados de riesgo TBE se ha incrementado de 65 a más de 140.
Y no sólo la extensión geográfica de las garrapatas alertó a los investigadores: durante años se observa que se han extendido en parte la incidencia de garrapatas infectadas de baja sierras alrededor de 800 metros de altura en las zonas de montaña alpinos alrededor de 1.500 metros. Otra indicación de que, como resultado de un desarrollo a largo plazo, considere los dos operadores de Berlín del "tic-radar", Olaf Kahl y Hans Dautel, que es esencial a avanzado por el cambio climático. Los dos científicos a crear su propia manera regular durante algún tiempo, puede recuperar en un previsiones de aplicaciones móviles (Zeckenwetter.de ) para la actividad de la garrapata, basadas principalmente en los datos de sus datos meteorológicos profesionales.
Dautel ha demostrado experimentalmente la resistencia que las sanguijuelas son: Aire libre llegan hasta diez años sin una comida de sangre de, en pisos secos pueden sobrevivir durante un máximo de diez días, y se sumergió bajo el agua, sobreviven durante un máximo de un mes sin problemas. Un ciclo de lavado sólo es potencialmente mortal para el oculto en prendas garrapatas cuando los bichos están expuestos durante un tiempo de unos 60 grados. Por lo tanto, considerada aún más la pieza más importante del consejo: escanear el cuerpo y la ropa Tras el paseo por la naturaleza en virtud de Jardinería fondo.

martes, 18 de marzo de 2014

Estímulo-desencadenó la conversión destino de las células somáticas en la pluripotencia

Aquí se presenta un fenómeno de reprogramación celular único, llamado adquisición estímulo provocado de la pluripotencia (STAP), que no requiere ni la transferencia nuclear, ni la introducción de factores de transcripción. En el STAP, fuertes estímulos externos, tales como un factor de estrés de bajo pH transitoria reprogramadas células somáticas de mamíferos, resultando en la generación de células pluripotentes. A través de imágenes en tiempo real de células STAP derivadas de los linfocitos purificados, así como análisis de los reordenamientos de genes, encontramos que las células somáticas comprometidos dan lugar a células STAP mediante la reprogramación en lugar de la selección. STAP células mostraron una disminución sustancial en la metilación del ADN en las regiones reguladoras de los genes marcadores de pluripotencia.Inyección de blastocistos mostró que las células del STAP contribuyen de manera eficiente a los embriones quiméricos ya través de la transmisión de la línea germinal descendencia. También demostramos la derivación de líneas de células robustamente ampliables pluripotentes a partir de células del STAP. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la determinación del destino epigenética de células de mamíferos se puede convertir marcadamente de una manera dependiente del contexto de fuertes señales ambientales.

De un vistazo

Cifras

izquierda
  1. Conversión de Estímulo desencadenada de los linfocitos en células Oct4-GFP +.
    Figura 1
  2. Las células inducidas bajo pH Oct4-GFP + representan células pluripotentes.
    Figura 2
  3. La conversión de células STAP de una variedad de células mediante tratamiento de pH bajo.
    Figura 3
  4. Generación ratón quimérico a partir de células del STAP.
    Figura 4
  5. Células madre de células ES-como se pueden derivar de células STAP.
    La figura 5
  6. La conversión de las células hematopoyéticas a células Oct4-GFP + por una exposición de bajo pH.
    Datos extendidos de la fig. 1
  7. Cambio fenotípico durante la conversión de células STAP.
    Datos extendidos de la fig. 2
  8. Análisis de expresión génica durante la conversión STAP y ensayo de diferenciación del endodermo.
    Datos extendidos de la fig. 3
  9. Ensayo de formación de teratoma y caracterización de células Oct4-GFP-dim.
    Datos extendidos de la fig. 4
  10. En la caracterización in vitro de células del STAP.
    Datos extendidos de la fig. 5
  11. La conversión de las células del tejido en las células somáticas del STAP.
    Datos extendidos de la fig. 6
  12. Quimeras Generation con células del STAP.
    Datos extendidos de la fig. 7
  13. Caracterización molecular y celular de las células madre del STAP.
    Datos extendidos de la fig. 8
  14. Efectos de los distintos factores de estrés sobre la conversión STAP.
    Datos extendidos de la fig. 9
derecho

Introducción

En la vista de canalización del paisaje epigenético de Waddington, destino de las células somáticas se determinan progresivamente a medida que avanza la diferenciación celular, como ir cuesta abajo. En general se cree que la inversión de estado diferenciado requiere la manipulación física o genética artificial de la función nuclear como la transferencia nuclear 1 , 2 o la introducción de múltiples factores de transcripción 3 . Aquí se investigó la cuestión de si las células somáticas pueden someterse a la reprogramación nuclear simplemente en respuesta a los desencadenantes externos sin manipulación directa nuclear. Este tipo de situación se sabe que se producen en las plantas-drásticos cambios ambientales pueden convertir células somáticos maduros (por ejemplo, disociarse células de zanahoria) en células blastema inmaduras, de la que una estructura de toda la planta, incluyendo tallos y raíces, se desarrolla en la presencia de auxinas 4 . Un desafiante pregunta es si las células somáticas de los animales tienen un potencial similar que surge bajo condiciones especiales. Durante la última década, la presencia de células pluripotentes (o tipos de células estrechamente pertinentes) en los tejidos adultos ha sido un tema de debate, por lo que las conclusiones contradictorias han sido reportados por varios grupos 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Sin embargo, ningún estudio hasta la fecha ha demostrado que tales células pluripotentes pueden surgir a partir de células somáticas diferenciadas.
Células hematopoyéticas positivas para CD45 (antígeno común de leucocitos) son las células somáticas de linaje comprometido típicos que nunca expresan marcadores relacionados con la pluripotencia-tales como Oct4 a menos que se reprograman 12 , 13 . Por lo tanto, abordó la cuestión de si esplénica CD45 + células podrían adquirir pluripotencia por cambios drásticos en su ambiente externo tales como las causadas por perturbaciones químicas simples.

El pH bajo provoca la conversión destino en las células somáticas

CD45 + células fueron ordenados por células activadas por fluorescencia (FACS) de la fracción de linfocitos de los bazos postnatales (1-semanas de edad) de ratones C57BL / 6 ratones portadores de un Oct4-GFP transgén 14 , y fueron expuestos a diferentes tipos de fuerte, transitoria estímulos, físicos y químicos (descritas a continuación). Examinamos estas células para la activación del Oct4promotor después de la cultura durante varios días en suspensión usando medio DMEM/F12 complementado con el factor inhibitorio de leucemia (LIF) y B27 (en lo sucesivo denominado medio LIF + B27). Entre las diversas perturbaciones, estábamos particularmente interesados ​​en las perturbaciones de pH bajo, por dos razones. En primer lugar, como se muestra a continuación, el tratamiento de bajo pH resultó ser más eficaz para la inducción de Oct4 . En segundo lugar, la embriología experimental clásica ha demostrado que un tratamiento de bajo pH transitorio en condiciones subletales '' puede alterar el estado de diferenciación de los tejidos. Conversión neuronal espontánea de polos animales de salamandra remojando los tejidos en medio ácido a base de citrato por debajo de pH 6,0 se ha demostrado previamente 15 , 16 , 17 .
Sin la exposición a los estímulos, ninguna de las células clasificadas con CD45 expresado Oct4 -GFP independientemente del periodo de cultivo en medio LIF + B27. En contraste, un tratamiento de 30 minutos con medio de pH bajo (25-min de incubación seguido por centrifugación de 5 min; . Fig. 1a ; la gama más efectiva fue pH 5.4 hasta 5.8; . datos extendidos de la Fig. 1a ) causó la aparición de sustancial número de racimos esféricos que expresaban Oct4 -GFP en el día 7 de cultivo ( Fig.. 1b ). Un número considerable de GFP + células aparecieron en todos los casos realizados con células esplénicas neonatales ( n = 30 experimentos). La aparición de Oct4 -GFP +células a expensas de CD45 + células también se observó por citometría de flujo ( Fig.. 1c , la parte superior, y datos extendidos de la fig. 1b, c ). A continuación fraccionado CD45 + células en poblaciones positivas y negativas para CD90 (células T), (células B) CD19 y CD34 (progenitores hematopoyéticos 18 ), y los sometió a un tratamiento de bajo pH. Las células de estas fracciones, incluyendo células T y B, generados Oct4- GFP + células en una eficacia comparable a la no fraccionadas CD45 + células (25-50% de las células en el día 7 supervivientes), excepto para CD34 + progenitores hematopoyéticos 19 , que rara vez producen Oct4- GFP + células (<2%; . datos extendidos Fig. 1d ).
Figura 1: la conversión del estímulo provocado de linfocitos en Oct4- GFP + células.
Conversión de Estímulo desencadenada de los linfocitos en células Oct4-GFP +.
una ., Esquema de bajo pH tratamiento b , Oct4- GFP + células grupos apareció en la cultura de bajo pH tratados CD45 + células (medio; una gran ampliación, a la derecha) en el día 7 (D7), pero no en la cultura de CD45 de control + células (izquierda). Arriba: Vista de campo brillante; parte inferior, las señales de las buenas prácticas agrarias. La barra de escala, 100 μ m. c , el análisis FACS. La x eje muestra el nivel de epifluorescencia CD45, y eje muestra Oct4- GFP nivel. No tratado, se cultivaron en el mismo medio pero no tratada con un pH bajo. d , GFP + (verde) y GFP - (amarillo) poblaciones de células (número de células promedio por campo visual; × 10 de lentes de objetivo). n = 25; de error barras muestran la media ± sd e , instantáneas de imágenes en vivo de la cultura de bajo pH tratados con CD45 + células ( Oct4-GFP ). Las flechas indican las células que comenzaron expresando Oct4- GFP. La barra de escala, 50 μ m. f , la reducción del tamaño de la célula en pH bajo tratados con CD45 + células en el día 1 antes de encenderOct4- GFP sin división celular en el día 2. En esta imagen en vivo, las células se sembraron a una densidad media para facilitar la visualización de las células individuales. La barra de escala, 10 μ m. g , análisis con microscopio de electrones. La barra de escala, 1 μ m. h , Adelante dispersión análisis deOct4- GFP - CD45 + células (rojo) y Oct4- GFP + CD45 - células (verde) en el día 7. La línea azul, las células ES. i , análisis de PCR genómico de (D) J recombinación en la TCRB gen. GL es el tamaño del tipo de línea germinal no reordenado, mientras que las escaleras más pequeños corresponden a los reordenamientos alternativas de J exones. Los controles negativos, las calles 1, 2, controles positivos, calle 3, FACS-ordenados Oct4- GFP + células (dos preparaciones independientes en el día 7), los carriles 4, 5.
Entre los medios de mantenimiento de células pluripotentes 20 , la aparición de Oct4- GFP +células fue más eficiente en medio de LIF + B27, y no se produjo en ratón epiblasto-derivados de células madre (Episc) medio de 21 , 22 ( . Ampliada Fig. datos 1e ). La presencia o ausencia de LIF durante 0-2 días no afectó sustancialmente la frecuencia de Oct4 -GFP + generación de células en el día 7 ( 1f extendida. datos Fig. ), mientras que la adición de LIF durante 4-7 días no fue suficiente, lo que indica que la dependencia LIF se inició durante los días 2-4.
La mayor parte de las células supervivientes en el día 1 eran todavía CD45 + y Oct4 -GFP - . El día3, los números de células totales se redujeron a entre un tercio y la mitad de la población día 0 (Fig. 1d. ; ver . datos extendidos de la figura 1g, h para el análisis de la apoptosis), y un número sustancial de células totales supervivientes se convirtió Oct4 -GFP + ( Fig.. 1d ), aunque con una intensidad de señal relativamente débil. El día 7, un número significativo de Oct4 -GFP + CD45 -células (entre la mitad y dos tercios del total de células que sobreviven) constituía una población distinta de la Oct4 -GFP - CD45 - células ( Fig. 1c. , arriba, en el día 7 , y . Fig. 1d ). No se obvia la generación de Oct4 -GFP + CD45 - poblaciones se observó en los no tratados CD45 + células cultivadas de manera similar pero sin tratamiento de pH bajo ( Fig. 1c. , parte inferior).
Bajo pH tratados CD45 + células, pero no las células no tratadas, se volvieron poco a poco en las señales de las buenas prácticas agrarias en los primeros días ( . Fig. 1e , Videos complementarias 1 y 2 y Extended. Datos Fig. 2a ), mientras que CD45 inmunoreactividad fue reducido gradualmente en el células que demostraron -Oct4 expresión de GFP ( . Fig. 1f y . Extended Data Fig. 2b ). Durante el día 5, los Oct4 -GFP + células unidas entre sí y forman racimos por acreción.Estas buenas prácticas agrarias + racimos (pero no de las buenas prácticas agrarias - células) fueron bastante móvil y, a menudo mostraron procesos celulares en movimiento ( vídeo 1 complementario ).
Los Oct4 -GFP + células demostraron un tamaño de celda pequeño característica con poco citoplasma y también mostraron una estructura fina distinta del núcleo en comparación con la de los padres CD45 + linfocitos ( Fig.. 1g ). Los Oct4 -GFP + células en el día 7 eran más pequeños que CD45 no tratado + células ( . Fig. 1 g, h y datos extendidos de la fig. 2c ) y células (ES) (madre embrionarias . Fig. 1h ), ambos de los cuales generalmente se consideran a ser pequeño en tamaño. El diámetro de CD45 bajo pH tratada + células se convirtió reducido durante los primeros 2días, incluso antes de haber comenzado Oct4 -GFP expresión ( . Fig. 1f ), mientras que la aparición de la expresión de GFP no fue acompañada de divisiones celulares. Consistente con esto, no 5-etinil-2'-desoxiuridina sustancial (UDE) absorción se observó en los Oct4 -GFP + células después del estresor ( 2d. Extended Fig. datos ).
La falta de una proliferación sustancial argumenta en contra de la posibilidad de que CD45 -células, contaminando como una población muy pequeña en los ordenados-FACS CD45 + células, rápidamente crecieron y formaron una sustancial Oct4 -GFP + población durante los primeros días después de que el bajo pH tratamiento. Además, reordenamientos genómicos de TCRB se observaron (gen receptor de células T) en Oct4- GFP + células derivadas de CD45 purificadas en FACS + células y CD90 + CD45 + células T ( . Fig. 1i , carriles 4, 5, y datos extendidos Fig. 2e-g ), lo que indica al menos una cierta contribución de las células T de linaje-comprometido. Por lo tanto,Oct4 -GFP + se generaron células de novo de bajo pH tratados con CD45 + células hematopoyéticas por la reprogramación, en lugar de mediante la simple selección de células con el estrés duradera 23 .

Inducidas bajo pH Oct4 + células tienen pluripotencia

El día 7, los Oct4 -GFP + esferas expresan proteínas marcadoras relacionadas pluripotencia- 22(Oct4, SSEA1, Nanog y E-cadherina, . Figura 2a ) y genes marcadores ( Oct4 , Nanog , Sox2 ,ECAT1 (también llamado Khdc3 ), ESG1 ( Dppa5a ), Dax1 ( Nrob1 ) y Rex1 ( Zfp42 ); . Fig. 2b ydatos extendidos de la Fig. 3a. ) de una manera comparable a los observados en las células ES 24. Se observaron niveles moderados de expresión de estos genes marcadores de pluripotencia en el día 3 ( . Figura 2b y Extended Data fig. 3b ). En particular, los Oct4 -GFP + células en el día 3, pero no en el día 7, expresaron primeros genes marcadores hematopoyéticos, tales como Flk1(también llamado Kdr ) y TAL1 ( datos extendidos de la fig. 3c ), lo que indica que Oct4 -GFP +células en día 3, a juzgar por su patrón de expresión a nivel de población, estaban todavía en un proceso dinámico de la conversión.
Figura 2: inducida bajo pH- Oct4- GFP + células representan las células pluripotentes.
Las células inducidas bajo pH Oct4-GFP + representan células pluripotentes.
una , inmunotinción para marcadores de células pluripotentes (rojo) en el día 7 Oct4- GFP +conglomerados (verde). DAPI, blanco. La barra de escala, 50 μ m. b , análisis qPCR de genes marcadores de pluripotencia. De izquierda a derecha, células ES de ratón, los padres CD45 + células; bajo pH inducida por Oct4- GFP + células en día 3, inducida bajo pH Oct4- GFP + células en el día 7. n = 3; barras de error indican la media ± sd c , DNA estudio de metilación por secuenciación de bisulfito. Llenan y círculos blancos indican metilado y no methlylated CpG, respectivamente. d , Inmunotinción análisis de in vitro la capacidad de diferenciación de los días 7 Oct4- GFP + células. El ectodermo: los marcadores neuronales Sox1/Tuj1 (100%, n = 8) y N-cadherina (100%, n = 5). Mesodermo: actina de músculo liso (50%, n = 6) y brachyury (40%, n = 5). Endodermo: Sox17/E-cadherin (67%, n = 6) y Foxa2/Pdgfr α (67%,n = 6). La barra de escala, 50 μ m. e , ensayo de formación de teratoma de día 7 grupos de Oct4- GFP +células. Hematoxilina y eosina mostraron epidermis queratinizada (ectodermo), músculo esquelético (mesodermo) y vellosidades intestinales (endodermo), mientras que la inmunotinción mostró expresión de Tuj1 (neuronas), actina de músculo liso y α -fetoproteína. La barra de escala, 100 μ m. f - i , la cultura de disociación de células madre embrionarias y las células del STAP (adicionales 7 días a partir del día 7, f ,g ) en placas recubiertas de gelatina. Top, campo brillante; parte inferior, la fosfatasa alcalina (AP) tinción.Células STAP parcialmente disociadas generado lentamente pequeñas colonias ( i ), mientras que las células disociadas STAP no lo hicieron, incluso en presencia del inhibidor de roca ( g , h ), que permite la disociación de la cultura EpiSCs 29 .
El día 7, a diferencia de CD45 + células y al igual que las células madre embrionarias, inducida por bajo pH Oct4 -GFP + células muestran extensa desmetilación en los Oct4 y Nanog áreas promotoras ( . Fig. 2c ), lo que indica que estas células se sometieron a una reprogramación sustancial de estado epigenético en estos genes clave para la pluripotencia.
En in vitro ensayos de diferenciación 25 , 26 , 27 demostraron que bajo inducida pH Oct4 -GFP +células dieron lugar a derivados de tres capas germinales ( . Fig. 2d ), así como visceral-endodermo como epitelio ( Fig. extendido de datos. 3d ) . Cuando injertado en ratones, de bajo pH inducida por Oct4 -GFP + grupos de células formaron los teratomas (40%, n = 20) ( 2e. figura ydatos extendidos de la fig. 4a-c ), pero no hay teratocarcinomas que persistentemente conteníanOct4- GFP + células ( n = 50). Porque alguna variación celular se observó en los niveles de señal de Oct4 -GFP dentro de los grupos, nos lo solucionaron células GFP-fuerte (una población importante) y las células GFP-dim (una población menor de edad) por FACS en el día 7 y por separado las inyectaron en los ratones . En este caso, sólo las células GFP-fuertes forman teratomas ( Extended Data Fig. 4d ). En la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa análisis (qPCR), la población-GFP fuerte expresó genes marcadores de pluripotencia pero no principios de los genes marcadores específicos de linaje, mientras que las células GFP-dim mostraron una expresión importante de algunos genes marcadores específicos de linaje tempranas ( Flk1 , GATA2 , Gata4 , Pax6 y Sox17 ; . datos extendidos Fig. 4e ), pero no Nanog y Rex1 . Estas observaciones indican que los derivados de tres capas germinales se generan a partir de las células-GFP fuerte que expresan genes marcadores de pluripotencia, en lugar de a partir de células GFP-tenue que parecen contener células parcialmente reprogramadas.
Colectivamente, estos resultados muestran que el estado de diferenciación de un compromiso de linaje de células somáticas se puede convertir en un estado de pluripotencia por estímulos fuertes dadas externamente. En adelante, nos referiremos a la conversión destino de las células somáticas en células pluripotentes por fuertes estímulos externos, tales como un bajo pH como "adquisición de estímulo-desencadenada de la pluripotencia" (STAP) y las células resultantes como las células del STAP. Bajo las condiciones del establecimiento, estas células STAP eran raramente proliferativa ( Extended Data figuras 2d y 5a, b ). Análisis comparativo gama de hibridación genómica de las células del STAP indicó ningún cambio importante a nivel mundial en el número de cromosomas ( Extended. Datos Fig. 5c ).

Células del STAP en comparación con las células madre embrionarias

Células del STAP, a diferencia de las células madre embrionarias de ratones, mostraron una capacidad limitada para la auto-renovación en el medio que contiene LIF-y no se formaron de manera eficiente colonias en la cultura de disociación ( . Fig. 2f, g ), incluso en presencia del inhibidor de la ROCA Y-27632 , que suprime la apoptosis inducida por la disociación- 28 , 29 ( . Fig. 2h ). Además, incluso bajo condiciones de cultivo de alta densidad después de la disociación parcial ( . Fig. 2i ), el número de células STAP comenzaron a disminuir considerablemente después de dos pasajes. Además, la expresión de la proteína marcadora de células ES Esrrβ fue baja en células STAP ( . Ampliada Fig. datos 5d, e ). En general, las células madre embrionarias femeninas no muestran cromosoma X inactivación 30 y no contienen focos H3K27me3 denso (indicativo de cromosomas X inactivos), a diferencia de CD45 femeninos + células y EpiSCs. En contraste, focos H3K27me3-densos se encontraron en ~ 40% de células STAP hembra fuertemente positivos paraOct4- GFP ( Fig. extendido de datos. 5f, g ).
Células STAP también eran diferentes a EpiSCs ratón, otra categoría de células madre pluripotentes 21 , 22 , 29 , 31 , y fueron positivos para Klf4 y negativos para los marcadores epiteliales apretado nudo Claudín 7 y ZO-1 ( 5d, e. Extended Fig. datos ).

Células del STAP de otras fuentes de tejidos

A continuación realizó experimentos de conversión similares con células somáticas recogidos de cerebro, la piel, los músculos, la grasa, la médula ósea, los pulmones y los tejidos del hígado de 1 semana de edad -Oct4 GFP ratones. Aunque la eficacia de conversión varió, la generación desencadenada-bajo pH de Oct4- GFP + células se observó en 7 días la cultura de todos los tejidos examinados ( . Fig. 3a y Fig. Extended Data. 6a-c ), incluyendo las células mesenquimales de tejido adiposo ( Fig. . 3a-c ) y las células cardíacas neonatales que fueron ordenados negativamente para CD45 por FACS ( Fig. 3d-g. ; ver Fig. Extended datos 6D. para la supresión de los genes cardiacos tales como Nkx2-5 y la actina cardiaca).
Figura 3: la conversión de células STAP de una variedad de células mediante tratamiento de pH bajo.
La conversión de células STAP de una variedad de células mediante tratamiento de pH bajo.
una , Porcentaje de Oct4- GFP + células en el día 7 de cultivo de células de pH bajo tratados de diferentes orígenes (1 × 10 5 células por ml ml). El número de células supervivientes en el día 7 en comparación con el número de célula de recubrimiento fue del 20-30%, excepto para las células de pulmón, muscular y adiposo, para el cual las células supervivientes fueron ~ 10% ( n = 3, media ± SD). BOct4 - GFP + células racimos fueron inducidos por el tratamiento de bajo pH del tejido adiposo derivadas de tejido de células mesenquimales en el día 7. La barra de escala, 100 μ m. c , La expresión de marcadores de células pluripotentes en día 7 racimos de tejido adiposo derivadas de tejido de células mesenquimales de pH bajo tratados. La barra de escala, 50 μ m. d , La expresión de los genes marcadores de pluripotencia en células STAP derivadas de diversos tejidos. Expresiones de genes se normalizaron por Gapdh ( n = 3, media ± DE). El asterisco indica las células mesenquimales derivadas de tejido adiposo. correo , Cuantificación de Oct4- GFP + células en cultivo de células de músculo cardiaco de pH bajo tratados neonatales. *** P < 0,001; prueba de Tukey ( n = 3). F , Generación de Oct4- GFP +células cúmulos (D7) de CD45 - células del músculo cardíaco. g , qPCR análisis de genes marcadores de pluripotencia en células STAP de CD45 - cardiaca las células musculares.

Formación de Quimera y la transmisión de la línea germinal en ratones

A continuación realizó un ensayo de inyección de blastocisto con células STAP que se generaron a partir de CD45 + células de ratones neonatales constitutivamente expresan GFP (esta línea C57BL / 6 con -cag GFP transgenes se denomina en lo sucesivo como B6GFP). Hemos inyectado grupos de células STAP en bloque que se corta manualmente en trozos pequeños usando un microknife (fig. 4a ). Una contribución de alto a moderado de las células que expresan GFP se observó en los embriones quiméricos ( . Fig. 4b y datos extendidos de la fig. 7a ). Estos ratones quiméricos nacieron a un ritmo considerable y todo se desarrollaron normalmente ( . Fig. 4c y Extended Data fig. 7b ).
Figura 4: Generación quimérico de ratón a partir de células del STAP.
Generación ratón quimérico a partir de células del STAP.
una , Esquema de la generación de ratón quimérico. b , fetos quimeras E13.5 de blastocitos 2N inyectados con células STAP (derivados de B6GFP CD45 + células portadoras de cag-GFP ). c , Adulto ratones quiméricos generados por celda STAP (B6GFP × 129 / Sv; agouti) inyección en blastocistos (cepa ICR; albino). El asterisco indica un ratón quimérico. Altamente contribuido d , el análisis de la contribución Quimera. Los tejidos de los nueve cachorros se analizaron por FACS. correo , Hijos de los ratones quiméricos derivados de las células del STAP. El asterisco indica el mismo ratón quimérico se muestra en la c . f , embrión E10.5 generada en el ensayo de complementación tetraploide con células STAP (B6GFP × 129/Sv).
CD45 + células STAP derivadas de células contribuyeron a todos los tejidos examinados ( Fig.. 4d). Además, derivada de células STAP crías nacieron a los ratones quimérico ( . Fig. 4e y extendida. datos Fig. 7C ), lo que demuestra su transmisión de la línea germinal, que es un criterio estricto para la pluripotencia, así como la normalidad genética y epigenética 32 , 33 . Además, en un (4N) ensayo de complementación tetraploide, que se considera que es la prueba más rigurosa para la potencia de desarrollo 34 , 35 ( . Fig. 4a , la parte inferior), CD45 + células STAP derivadas de células (de F 1 ratones de B6GFP × 129 / Sv o DBA / 2) generaron todo-GFP + embriones en el día embrionario (E) 10,5 ( . Fig. 4f , extendida la figura de Datos. 7d y complementario Video 3 ), lo que demuestra que las células del STAP por sí solos son suficientes para construir una estructura embrionaria entero. Por lo tanto, las células STAP tienen la capacidad de desarrollo para diferenciarse en todos los linajes de células somáticas así como linajes de células germinales in vivo .

Expandible líneas celulares pluripotentes a partir de células del STAP

Células STAP tienen una capacidad de auto-renovación limitada en las condiciones utilizadas para la creación ( . Fig. 2g y ampliada Figs datos 2e y 5a ). Sin embargo, en el contexto del entorno embrionario, un pequeño fragmento de un grupo de células STAP podría crecer incluso en todo un embrión ( 4f. Fig. ). Con esto en mente, el próximo examinó si las células del STAP tienen el potencial de generar líneas celulares pluripotentes expandibles in vitro bajo ciertas condiciones.
Células STAP no se podrían mantener de manera eficiente para pasajes adicionales en LIF convencional + medio o medio 2i contenía FBS al 20 (la mayoría de las células del STAP murieron en medio 2i plazo de 7 días; datos extendidos de la figura 8a. ). En particular, una hormona adrenocorticotrópica (ACTH) + medio que contiene LIF-(en lo sucesivo denominado medio de ACTH) conocidos para facilitar la expansión clonal de células ES 36 excrecencia apoyado de colonias de células STAP. Cuando se cultivan en este medio en un alimentador de MEF o gelatina, una parte de los grupos de células STAP comenzó a crecer ( Fig. 5a. , parte inferior; tales consecuencia se encuentra típicamente en el 10-20% de los pozos en cultivo único clúster utilizando placas de 96 pocillos y se en> 75% cuando 12 agrupaciones se sembraron por pocillo).Estas colonias que crecen tenían un aspecto similar a las de las células ES de ratón y expresaron un alto nivel de Oct4- GFP.
Figura 5: células madre de células ES-como se pueden derivar de células STAP.
Células madre de células ES-como se pueden derivar de células STAP.
una , el crecimiento de las células madre que llevan STAP Oct4-GFP . La barra de escala, 50 μ m. b , cultura disociación de las células madre STAP para formar colonias. La barra de escala, 100 μ m. c , el crecimiento robusto de las células madre STAP en la cultura de mantenimiento. Se obtuvieron resultados similares con ocho líneas independientes. En contraste, las células parentales STAP disminuyeron en número rápidamente. d , inmunotinción de las células madre STAP para marcadores de pluripotencia (rojo). La barra de escala, 50 μ . m e ., el análisis qPCR de expresión del gen marcador pluripotencia f - hin vitro ensayos de diferenciación en derivados de tres capas germinales. f , Ectodermo: Rx + / Pax6 +(epitelio de la retina, el 83%, n = 6). g , mesodermo: troponina-T + (músculo cardiaco, el 50%, n . = 6) h , endodermo: SOX17 + / E-cadherina + (progenitores endodérmicas; 67%, n = 6). La barra de escala, 50 μm. i , ensayos de formación de teratomas. La formación de la epidermis queratinizada (ectodermo, izquierda), el cartílago (mesodermo; medio) y-al igual que el epitelio bronquial (endodermo, derecha) se muestra. La barra de escala, 100 μ m. j , ensayos de inyección de blastocistos. Estas imágenes de animales vivos se tomaron en serie (asterisco indica el mismo cachorro quimérico). k , l , ensayo de complementación tetraploide. 'All-GFP + 'cachorros nacieron ( k ) y la transmisión de la línea germinal se observó ( l ).
Después de cultivar en un medio de ACTH durante 7 días, este crecimiento de la población de células, a diferencia de las células parentales STAP, se pudo pasar como células individuales ( . Fig. 5a , parte inferior, y la fig. 5b ), crecer en medio 2i ( datos extendidos de la fig. 8a ) y ampliar de manera exponencial, hasta por lo menos 120 días de cultivo ( Fig. 5c. ; ninguna anormalidad cromosómica sustancial fue visto; . datos extendidos figura 8b, c ). En adelante, nos referiremos a las células derivadas de células proliferativas STAP como células madre STAP.
Células madre STAP expresado marcadores de proteínas y de ARN para células pluripotentes ( . Fig. 5d, e ), mostró bajos niveles de metilación del ADN en el Oct4 y Nanog loci ( extendida. datos Fig. 8d ), y tenía una estructura fina nuclear similar a la de las células ES ( Extended Data Fig. 8e. ; pocas áreas electrón-densos correspondiente a heterocromatina). En la cultura de diferenciación25 , 26 , 27 , las células madre generadas STAP ectodérmicas, mesodérmicas y endodérmico derivados in vitro ( . Fig. 5f-h y Ampliada Fig. datos. 8f, g ), incluyendo superando a los músculos cardíacos ( Vídeo complementario 4 ), y forman teratomas in vivo (Fig.5i y extendida de datos Fig. 8h. ; no hay teratocarcinomas, n = 40). Después de la inyección de blastocistos, células madre STAP contribuyeron de manera eficiente a los ratones quimérico ( . Fig. 5j ), en el que la transmisión de la línea germinal se observó ( Fig. extendido de datos. 8i ). Incluso en los ensayos de complementación tetraploide, inyectaron células madre STAP podrían generar ratones capaces de crecer a los adultos y producir descendencia ( Fig. 5 k, l. , en las ocho líneas independientes, . Extended Data Fig. 8j ).
Además de su capacidad de expansión, nos dimos cuenta de por lo menos otras dos diferencias entre las células madre y las células STAP STAP parentales. En primer lugar, la expresión de la proteína marcadora de células ES Esrrβ, que era indetectable en las células STAP ( . Ampliada Fig. 5d de datos, e ), se vio claramente en células madre (STAP . Fig. 5e ). En segundo lugar, la presencia de focos H3K27me3, que fue encontrado en una proporción sustancial de las células del STAP femeninos, ya no se observó en las células madre del STAP ( Extended Data figuras 5f y 8k). Por lo tanto, las células STAP tienen el potencial de dar lugar a líneas celulares expandibles que exhiben características similares a las de las células ES.

Discusión

Este estudio ha revelado que las células somáticas latente poseen una plasticidad sorprendente.Esta plasticidad-la dinámica capacidad de convertirse en células pluripotentes-surge cuando las células están transitoriamente expuestos a estímulos fuertes que normalmente no experimentan en sus entornos de vida.
Tratamiento de bajo pH también se utilizó en el experimento 'autoneuralization' 15 , 16 , 17 por Holtfreter en 1947, en los que la exposición al medio ácido causado autónoma de tejido neural conversión de salamandra polos animales in vitro en ausencia de señales del organizador de Spemann. Aunque el mecanismo ha seguido siendo difícil de alcanzar, Holtfreter la hipótesis de que el fuerte estímulo libera las células animales tapa de algunos mecanismos inhibitorios intrínsecos que inhiben la conversión de destino o, en sus palabras, que pasan a través de 'citolisis subletal' (que significa lisis provocada por estímulo de inhibidor de la célula estado) 15 , 37 . Aunque el estudio y el nuestro de Holtfreter difieren en la dirección de destino diferenciación conversión ortógrado y la reprogramación nuclear, respectivamente-estos fenómenos pueden compartir algunos aspectos comunes, en particular en lo que respecta a la liberación provocada por estímulo subletal de una estática (conversión-resistencia) del estado en la celda .
Una cuestión pendiente es si la reprogramación celular se inicia específicamente por el tratamiento de pH bajo o también por algunos otros tipos de estrés subletal, tales como daño físico, perforación de la membrana de plasma, choque de presión osmótica, la privación del factor de crecimiento, de choque térmico o de alta Ca 2 + la exposición. Al menos algunos de estos factores de estrés, daños particularmente por trituración física rigurosa y perforación de la membrana por estreptolisina O, inducida por la generación de Oct4 -GFP + células de CD45 + células ( Fig. extendida de datos 9a.; ver Métodos). Estos resultados plantean la posibilidad de que ciertos módulos reguladores comunes, mintiendo abajo de estas tensiones subletales alejadas, actúan como una clave para la liberación de células somáticas de la epigenética estado firmemente cerrada de diferenciación, lo que lleva a un cambio global en la regulación epigenética. En otras palabras, las funciones celulares desconocidos, que se activa por estímulos subletales, pueden fijar las células somáticas libres de su compromiso actual para recuperar el estado de la célula ingenua.
Nuestro hallazgo presente de una forma inesperada gran capacidad de reprogramación radical en las células somáticas comprometidos plantea varias preguntas importantes. Por ejemplo, por qué y con qué finalidad, qué células somáticas poseen latente esta capacidad de auto-impulsado por la reprogramación nuclear, que emerge sólo después de la estimulación subletal, y entonces, ¿cómo es este mecanismo de reprogramación normalmente reprimida? Por otra parte, ¿por qué no es teratoma (o masa de células pluripotentes) formación normalmente visto en vivo en los tejidos que pueden recibir un fuerte estrés ambiental? En nuestro estudio preliminar, la esofagitis por reflujo experimental inducida localmente moderada expresión de Oct4- GFP, pero no endógena Nanog en el ratón mucosa esofágica ( Extended Data Fig. 9b ). Por lo tanto, una intrigante hipótesis para futuras investigaciones es que la progresión de la inicial Oct4 activación para más reprogramación es suprimida por ciertos mecanismos inhibitorios in vivo .
La pregunta de por qué y cómo esta reprogramación automotor se dirige hacia el estado pluripotente es de fundamental importancia, dado que la reprogramación STAP toma un período extraordinariamente corto, sólo unos pocos días para la expresión sustancial de genes marcadores de pluripotencia, a diferencia de transgenes o inducida por sustancias químicas IPS conversión celular 38 . Por lo tanto, nuestros resultados arrojan nueva luz sobre el significado biológico de diversos estados celulares en organismos multicelulares.