domingo, 9 de julio de 2017

El árbol genealógico más complicado en biología

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Ilustración de Jasiek Krzysztofiak / Naturaleza
Durante 18 meses a principios de los 80, John Sulston pasó sus días viendo cómo los gusanos crecían. Trabajando en turnos gemelos de 4 horas cada día, Sulston entrenaba un microscopio de luz sobre un solo embrión de Caenorhabditis elegans y dibujaba lo que veía a intervalos de 5 minutos, como un huevo fertilizado morphed en dos células, luego cuatro, ocho y así sucesivamente. Trabajó solo y en silencio en una pequeña habitación del Medical Research Council Laboratory de Biología Molecular en Cambridge, Reino Unido, la solución de un cubo de Rubik entre vueltas en el microscopio. "Me encontré con pequeñas distracciones", recordó una vez el biólogo retirado del Premio Nobel.
Sus centenares de dibujos revelaron la coreografía rígida del desarrollo temprano del gusano, que abarcaba los nacimientos de precisamente 671 células, y las muertes de 111 (o 113, dependiendo del sexo del gusano). Cada célula podía ser rastreada hasta su antecesor inmediato y luego a la anterior, en una serie de pasos invariantes. De estos mapas y otros, Sulston y sus colaboradores fueron capaces de elaborar el primer, y hasta ahora, el único "árbol de linaje celular" de un organismo multicelular 1 .
Especial Naturaleza : Biología de una sola célula
Aunque el deseo de registrar el desarrollo de un organismo en tan exquisito detalle precedió a Sulston en al menos un siglo, la capacidad de hacerlo en animales más complejos ha sido limitada. Nadie podría seguir el destino de miles de millones de células en un ratón o un ser humano con sólo un microscopio y un cubo de Rubik para pasar el tiempo. Pero hay otras maneras. Las revoluciones en la capacidad de los biólogos para editar genomas y secuenciarlos al nivel de una sola célula han desencadenado un renacimiento en el rastreo del linaje celular.
El esfuerzo está atrayendo no sólo a los biólogos de desarrollo, sino también a los genetistas y desarrolladores de tecnología, que están convencidos de que la comprensión de la historia de una célula - de dónde vino y hasta qué ha sucedido a ella - es una de las próximas grandes fronteras de la biología. Los resultados hasta el momento sirven algunas pistas tentadoras de cómo los seres humanos se ponen juntos. Las células individuales de un órgano como el cerebro podrían relacionarse más estrechamente con las células de otros órganos que con el tejido circundante, por ejemplo. Y a diferencia de la danza evolutiva incondicional de C. elegans , los organismos más complejos invocan bastante improvisación y azar, lo que complicará sin duda los esfuerzos para desentrañar la coreografíaPero incluso las ascendencias celulares incompletas podrían ser informativas. Los mapas de Sulston allanaron el camino para descubrimientos alrededor de la muerte celular programada y pequeñas moléculas de ARN reguladoras. Nuevos mapas podrían dilucidar el papel de las células madre en la regeneración de los tejidos o ayudar a combatir el cáncer, una enfermedad de la expansión del linaje desharrado. "Hay una sensación real de una nueva era", dice Alexander Schier, un biólogo de desarrollo en la Universidad de Harvard en Cambridge, Massachusetts, que está utilizando la edición del genoma para rastrear la historia del linaje celular del pez cebra y otros animales

Reconstruir la historia

La historia de una célula está escrita en su genoma: cada mutación adquirida que se transmite a las células hijas sirve como un registro. En 2005, el informático Ehud Shapiro del Instituto Weizmann de Ciencias en Rehovot, Israel, calculó que los investigadores podían usar las mutaciones naturales en células humanas individuales para reconstruir cómo se relacionan 2 . Él concibió un corolario (en concepto por lo menos) al mapa de la célula de C. elegans , que él llamó el proyecto humano del linaje de la célula. Pero el campo, dice, no estaba listo. "Cuando ofrecimos esta visión, ni el campo ni el nombre de la única célula genómica existía."
Avance rápido por una década, y los investigadores han desarrollado una serie de potentes herramientas para investigar la biología de las células solas, desde sus moléculas de ARN y sus proteínas hasta sus genomas individuales y únicos. Ahora, él prevé una manera de capturar el curso de desarrollo de un ser humano, marco por cuadro, de huevo fertilizado a adulto. "Quieres que toda la película con marcos 3D de principio a fin", dice. Para hacer tal película, ni siquiera es necesario mirar el genoma entero. El equipo de Shapiro se está enfocando en tramos repetitivos de ADN salpicado a través del genoma llamado microsatélites. Estas secuencias tienden a mutar con más frecuencia que otros fragmentos del genoma, y ​​su equipo está trabajando en secuenciar decenas de miles de ellos a través de los genomas de cientos de células humanas individuales para determinar cómo se relacionan.
"Estamos empezando a ver las reglas del desarrollo en seres humanos normales".
Christopher Walsh, neurocientífico y biólogo del desarrollo en el Hospital de Niños de Boston y la Facultad de Medicina de Harvard, duda de que los investigadores reconstruirán un mapa completo del linaje celular humano para que coincida con el de C. elegans , pero incluso un árbol incompleto pagará dividendos. dice. "He estado estudiando el linaje celular en la corteza durante 25 años, y la idea de estudiarlo directamente en el cerebro humano era un sueño inconcebible. Ahora es una realidad ".
En los experimentos descritos en 2015, el equipo de Walsh secuenció el genoma completo de 36 neuronas corticales de 3 personas sanas que habían muerto y donado sus cerebros a la investigación 3 . La reconstrucción de la relación entre las células cerebrales en un individuo reveló que las células estrechamente relacionadas se pueden esparcir a través de la corteza, mientras que las áreas locales pueden contener múltiples linajes distintos. Las sucesivas generaciones de células parecen aventurarse lejos de sus hogares ancestrales. Una neurona cortical, por ejemplo, estaba más estrechamente relacionada con una célula cardíaca de la misma persona que con las tres cuartas partes de las neuronas circundantes. "No esperábamos encontrar eso", dice Walsh.
El equipo de Walsh está tratando de entender cómo el mosaicismo en el cerebro - en el cual algunas células albergan diferentes variantes genéticas - afecta la salud. Han identificado, por ejemplo, formas de epilepsia que se producen incluso cuando sólo un pequeño porcentaje de células en una pequeña región del cerebro portan una mutación causante de la enfermedad. Y han descubierto que las neuronas individuales de individuos sanos pueden soportar mutaciones que causan convulsiones y esquizofrenia si están presentes más ampliamente. Parece de este trabajo que importa qué células terminan con una mutación. "El linaje básicamente determina qué enfermedades son posibles", dice WalshOtros científicos están descubriendo registros de los primeros eventos de la vida en los genomas de las células adultas. En los experimentos publicados este año 4 , Michael Stratton, un genetista en el Instituto Wellcome Trust Sanger en Hinxton, Reino Unido, y su equipo secuenciaron las células blancas de la sangre de 241 mujeres con cáncer de mama y buscaron mutaciones encontradas en sólo un subconjunto de sus células sanguíneas. El estudio reveló mutaciones que ocurrieron muy temprano en el desarrollo, tal vez desde el embrión de dos células. Y señalaron que los descendientes de estas células no contribuyen igualmente al sistema sanguíneo de los adultos. Esto podría ser porque una célula se multiplica más eficientemente que la otra; O podría, como Stratton sospecha, que por casualidad uno termina contribuyendo más a un feto en desarrollo que a una placenta u otros tejidos de apoyo.
Los estudios futuros, dice Stratton, buscarán cuellos de botella en el desarrollo que limiten la contribución de algunos linajes celulares. "Estamos empezando a ver las reglas del desarrollo en seres humanos normales", dice.

De blobs a códigos de barras

Jay Shendure, un genetista de la Universidad de Washington en Seattle, todavía recuerda el día en que se fascinó con las historias celulares. Como un niño de 14 años con un interés en la biología y las computadoras, escribió un programa que modeló una masa de células multiplicadoras para impresionar a su tío, un cirujano reconstructor que visitaba desde la India. "Él dijo, 'Esto es increíble. Un día harás lo mismo, y en lugar de una gota, será un bebé entero '", recuerda Shendure.
Casi una década después, Shendure era un estudiante graduado de primer año que trabajaba para el genetista George Church de Harvard. Church presentó una lista de ideas ("todas las cuales, en su momento, parecían totalmente absurdas", dice Shendure); Uno de ellos era reconstruir los linajes de muchas células a la vez, en un solo experimento. Shendure trabajó durante seis meses tratando de usar enzimas que lanzan ADN llamadas recombinasas para crear un registro legible en los genomas de las bacterias a medida que se dividen. En lugar de confiar en las mutaciones adquiridas naturalmente en el genoma, el sistema esencialmente crearía variantes para mantener un registro.
Shendure eventualmente cambió de proyecto, pero revivió la idea hace unos años cuando los estudiantes de posgrado Aaron McKenna y Greg Findlay se unieron a su laboratorio en Seattle. Se dieron cuenta de que la popular herramienta de edición del genoma CRISPR-Cas9 sería ideal para introducir mutaciones trazables a cualquier parte del genoma que quisieran (véase "Las líneas de sucesión"). En combinación con el laboratorio de Schier, desencadenaron CRISPR-Cas9 en dos embriones de pez cebra de una sola célula y le indicaron que modificara las secuencias de código de barras del ADN que habían sido manipuladas en sus genomas. Luego secuenciaron estos códigos de barras en las células de un animal adulto y utilizaron las mutaciones en ellos para reconstruir su linaje 5 .
Los árboles que producen muestran que un pequeño número de linajes embrionarios de formación temprana dan lugar a la mayoría de las células en un órgano dado. Más del 98% de las células sanguíneas de un pez, por ejemplo, provenían de sólo 5 de los más de 1.000 linajes celulares que el equipo trazó. Y aunque estos cinco contribuyeron a otros tejidos, lo hicieron en proporciones mucho más bajas. Estaban casi completamente ausentes de las células musculares en el corazón, por ejemplo, que se construyó sobre todo a partir de su propio número pequeño de precursores. "Fue profundamente sorprendente para mí", dice Shendure. Su colega Schier dice que todavía está tratando de dar sentido a los datos.
Jan Philipp Junker, biólogo cuantitativo de desarrollo en el Centro Max Delbrück de Medicina Molecular de Berlín, dice que los árboles de linaje celular de los embriones tempranos probablemente varían mucho entre individuos y que el dominio de los linajes particulares observados por Shendure y el equipo de Schier podría ser El resultado de eventos casual. Las células de un embrión temprano se mueven alrededor, y sólo una fracción de ellas contribuyen al organismo final, por ejemplo. Sería más revelador, añade, realizar un seguimiento de sucesos evolutivos posteriores, como la formación de las tres capas germinales que dan origen a diferentes órganos, ya que estos sucesos están menos gobernados por la suerte.
Junker y otros han desarrollado una serie de otras técnicas basadas en CRISPR para reunir historias de desarrollo. Él y Alexander van Oudenaarden, un biólogo de sistemas en la Universidad de Utrecht en los Países Bajos, aplicaron este enfoque para seguir la regeneración de una aleta dañada en el pez cebra. La regeneración, descubrieron, se produjo de la misma manera que el desarrollo: pocos de los linajes celulares que dieron origen a la aleta original se perdieron cuando se reconstruyó a partir de células madre. El hallazgo confirmó estudios previos, pero los métodos basados ​​en CRISPR permitieron al equipo rastrear linajes de miles de células en un solo experimento 6 .
Iglesia dice que su equipo ha utilizado CRISPR para estudiar el desarrollo del ratón y ha logrado grabar las divisiones de células embrionarias que dan lugar a las tres capas principales de germen, que forman todos los órganos del cuerpo 7 . "No creo que estemos tan lejos de hacer un linaje completo", dice.
Algunos investigadores se esfuerzan por saber no sólo cómo las células de un organismo se relacionan entre sí, sino lo que les sucedió a lo largo del camino. Michael Elowitz y Long Cai, tanto en el Instituto de Tecnología de California en Pasadena, han desarrollado un trazador de linaje que crea sondas fluorescentes para ayudarles a observar las historias de las células a medida que desarrollan 8 . Su método puede rastrear si ciertos genes de desarrollo se han activado en el pasado para un linaje dado. El 5 de julio, junto con Shendure y Schier, Elowitz recibió una donación de US $ 10 millones del Grupo Paul G. Allen Frontiers para combinar sus tecnologías. El trío planea desarrollar cromosomas sintéticos que actúan como magnetófonos para la historia del linaje celular y eventos moleculares.
Tales grabaciones podrían permitir a los científicos manipular el desarrollo de una célula de maneras más delicadas que las actuales técnicas de reprogramación de células, dice Tim Liu, biólogo sintético del Massachusetts Institute of Technology de Cambridge, quien también está trabajando en una tecnología para registrar la historia de una célula 9 . "Usted podría ver alguna versión de estos grabadores que se inserta en las terapias celulares del futuro", aunque no será por un tiempo, advierte. "No voy a ir a inyectar mi grabadora CRISPR a un paciente".

Linajes para la vida

El cáncer es el lugar donde nuevos métodos de rastreo de linaje tienden a hacer olas primero. "El cáncer es una enfermedad de linaje - es una enfermedad de las células madre", dice Walsh. Una pregunta que los investigadores están empezando a abordar es el origen de las células metastásicas, que emergen del tumor primario e invaden órganos a veces distantes. Tienden a ser las células tumorales más difíciles de vencer y las más propensas a matar a los pacientes.
Un equipo liderado por el genético del cáncer Nick Navin en el Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas en Houston publicó mapas de linaje de dos cánceres de colon el 10 demayo . Los resultados mostraron que las células metastásicas invasoras del hígado compartían muchas mutaciones de ADN con los tumores primarios de las que provenían, lo que sugiere que las metástasis habían surgido en una etapa tardía y no necesitaban un puñado de nuevas mutaciones para propagarse. El mapeo del linaje también podría mostrar si los tumores realmente se desarrollan a partir de células individuales, como han argumentado los genetistas, o si provienen de múltiples células, como algunos estudios de imágenes han sugerido. Navin sospecha que un trabajo similar podría ser utilizado para dirigir el tratamiento. Su equipo y otros están rastreando los linajes de células cancerosas en pacientes mientras comienzan a tomar drogas. Esperan que estos estudios puedan detectar linajes resistentes,
"El cáncer es una enfermedad de linaje - es una enfermedad de las células madre".
Por el momento, sin embargo, la promesa en el campo supera con creces la realidad. Y los mapas del linaje de C. elegans de Sulston todavía se ciernen sobre esfuerzos actuales. Stephen Quake, un bioingeniero de la Universidad de Stanford en California, ideó su propio método para el seguimiento de ascendencia celular a través de CRISPR y decidió probarlo en el gusano 11 . "Es bueno tener un estándar de oro", dice Quake. Él y su equipo secuenciaron las células de un animal maduro después de que CRISPR había mutado su genoma durante el desarrollo. Los esfuerzos tomaron mucho menos tiempo que el año y medio que Sulston gastó con su microscopio. Pero Quake dice que la imagen que desarrollaron también fue menos que completa. Sí, Capturó una transición clave en el desarrollo de lombrices - la segregación de las células unidas al intestino y las que dan lugar al resto del cuerpo - pero carecía del detalle exquisito que Sulston observó con sus ojos. "Voy a ser perfectamente romo. No estoy muy impresionado con mis resultados ", dice Quake, que ni siquiera había planeado publicar el trabajo hasta que vio la fiebre de otros papeles utilizando técnicas similares. "Nadie realmente lo ha lamido todavía", dice.
Hay un argumento a ser hecho que Sulston puso la barra demasiado alta con C. elegans . "Todo este concepto de árbol de linaje está muy influenciado por este trabajo clásico", dice Junker. Y eso puede merecer un replanteamiento.
En los peces, los ratones y los seres humanos, no es probable que los árboles de dos linajes de dos individuos se vean exactamente iguales, y cada uno probablemente cambia a lo largo de la vida del individuo, a medida que los tejidos se reparan y se regeneran. Junker y otros esperan que las nuevas técnicas permitan a los biólogos hacer preguntas acerca de la variabilidad en los árboles de linaje - entre individuos, entre sus órganos ya medida que envejecen. Como dice Schier: "No sabemos cuántas maneras hay de hacer un corazón".
Esa vasta desconocida que podría hacer que este trabajo sea transformador, dice Elowitz: "Cambiaría el tipo de preguntas que se podrían hacer". El mapa de Sulston llevó a los biólogos a territorio inexplorado, dice Schier, y esto podría hacer lo mismo. "No podemos decirle exactamente lo que vamos a encontrar, pero hay una sensación de que vamos a encontrar algunos nuevos continentes por ahí."
Naturaleza
 
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Doi : 10.1038 / 547020a