domingo, 27 de mayo de 2018

El ayuno intermitente a corta plazo

El ayuno intermitente (IF) puede mejorar la función y la salud durante el envejecimiento en organismos modelo de laboratorio, pero los mecanismos en acción aguardan la elucidación. Sometimos moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) a diversos grados de FI y descubrimos que solo un mes de un régimen de 2 días alimentados: 5 días de ayuno en ayunas al comienzo de la edad adulta era suficiente para extender la esperanza de vida. Este efecto beneficioso de larga duración de la IF temprana no se debió a una fecundidad reducida. La resistencia al hambre y la resistencia al estrés oxidativo y xenobiótico aumentaron después de la IF. La IF de los primeros años de vida también condujo a un mayor contenido de lípidos en las moscas de 60 días de edad, una posible explicación para el aumento de la longevidad. El vómito de las moscas 40 días después de la IF mostró una reducción significativa en las patologías relacionadas con la edad y la función mejorada de la barrera intestinal. La mejora de la salud intestinal también se asoció con una disminución de la abundancia bacteriana relativa. El IF temprano indujo cambios profundos a largo plazo. El análisis de epistasis farmacológica y genética mostró que IF actuó independientemente de la vía TOR porque la rapamicina y la IF actuaron de forma aditiva para extender la esperanza de vida, y la expresión global de un S6K constitutivamente activo no atenuó la extensión de la duración de vida inducida por IF. Concluimos que el IF a corto plazo durante la vida temprana puede inducir efectos beneficiosos duraderos, con un aumento robusto en la esperanza de vida de una manera independiente de TOR, probablemente al menos en parte al preservar la salud intestinal.

Introducción

El ayuno intermitente (IF, por sus siglas en inglés), un término genérico para las dietas que cambian de ayuno a ayuno, se ha vuelto cada vez más popular como un régimen de pérdida de peso (p. Ej., "Ayuno para todos los días" y "5: 2" dieta) [ 1 , 2]. Los defensores de IF argumentan que muestra muchos de los beneficios observados con las dietas tradicionales de restricción de energía diaria, pero con un régimen nutricional simplificado y un mayor cumplimiento [ 3 ]. Un estudio sobre los resultados clínicos del ayuno en mujeres jóvenes con sobrepeso describió una pérdida de peso significativa como resultado del régimen de FI, así como una reducción de la masa grasa y la circunferencia de la cintura, y un colesterol sérico, triglicéridos y proteína C reactiva reducidos [ 4 ]. Los ensayos clínicos piloto más recientes utilizaron una dieta imitadora en ayunas (FMD) (que consiste en ciclos mensuales de ayuno de 5 días durante los cuales la ingesta diaria de alimentos se redujo a ~50% de ingesta calórica normal), lo que redujo múltiples factores de riesgo de salud durante el período de recuperación posterior al ayuno, que incluye disminución de la presión sanguínea y niveles reducidos de glucosa en sangre y del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) [ 5 , 6 ]. Sin embargo, las revisiones sistemáticas de los beneficios clínicos de los regímenes de ayuno en humanos encontraron que los diseños de los estudios eran heterogéneos y los datos de cumplimiento limitados, lo que dificulta sacar conclusiones definitivas [ 7 , 8].
IF puede prolongar la vida útil en una variedad de organismos, incluyendo bacterias, levaduras, gusanos nematodos y ratones [ 9 ]. En modelos animales, el IF ha demostrado reducir el riesgo de desarrollar una variedad de patologías relacionadas con la edad [ 9 , 10 ]. IF es eficaz en la prevención de la neurodegeneración en roedores [ 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ] y puede atenuar el cáncer [ 16 ] y las enfermedades cardiometabólicas, como la diabetes tipo II [ 4 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21]. Recientemente se descubrió que la fiebre aftosa aumenta la regeneración de células β pancreáticas en modelos de diabetes en ratones [ 22 ].
DR, una reducción crónica de la ingesta de alimentos sin desnutrición, es un método conservado evolutivamente para mejorar la salud durante el envejecimiento y prolongar la vida útil [ 23 ]. Sin embargo, muchos estudios de la RD, particularmente en roedores, también implican el acceso intermitente a los alimentos, con los animales de DR que atiborran su comida reducida tan pronto como se les suministra, dejando períodos prolongados de tiempo en ayunas [ 24 ]. Los efectos beneficiosos para la salud que se observan en la RD pueden ser atribuibles, al menos en parte, a la inanición intermitente. Apoyar esta idea, realizar DR sin prolongados periodos de ayuno diluyendo la comida de los ratones DR con celulosa no digerible, restringiendo así la ingesta total de energía pero permitiendo un acceso constante a los alimentos, no prolongó la vida en comparación con los animales totalmente alimentados [ 25 ]. Por el contrario, muchos estudios en organismos invertebrados, como levadura, lombrices y Drosophila , donde el tratamiento DR implica el acceso continuo a alimentos diluidos, dan como resultado una prolongación de la vida útil robusta [ 26 ]. Por lo tanto, el ayuno periódico puede ser importante, pero probablemente no sea el único que contribuye a los efectos pro-longevidad de la RD, al menos en estos invertebrados.
La reducción de la actividad de las vías de detección de nutrientes, con la correspondiente disminución en la traducción de proteínas a nivel mundial, está implicada como un mecanismo importante que subyace a los efectos pro-longevidad de las intervenciones dietéticas, como la RD [ 23 ]. La reducción de la señalización TOR es un sello distintivo de las intervenciones de pro-longevidad, incluida la RD, y el tratamiento con el inhibidor de la TOR rapamicina prolonga la vida sana en una variedad de organismos [ 27 ]. Aunque DR puede ejercer algunos de sus efectos pro-longevidad a través de la fecundidad reducida, DR todavía puede extender la vida útil en Drosophila mutante Ovo D estéril , lo que implica que la fecundidad y la esperanza de vida pueden desacoplarse y que otros mecanismos también son importantes [ 28 ]. Un estudio reciente destacó la importancia de la homeostasis intestinal en la longevidad inducida por DR en Drosophila , porque ambos rescataron las patologías intestinales relacionadas con la edad y la vida útil prolongada en mujeres y en hombres con tripas feminizadas, pero no en hombres salvajes, que no se someten una patología intestinal significativa relacionada con la edad [ 29 ]. También se sabe que la composición de la dieta y el programa de transferencia de moscas también afectan la abundancia y la diversidad de las bacterias asociadas a la mosca [ 30 ], y cabe esperar que los períodos de ayuno modulen la microbiota asociada.
Los organismos modelo de invertebrados proporcionan contextos poderosos para establecer los mecanismos moleculares que median los efectos pro-longevidad de la IF. En levadura, Rim15, un integrador clave de señales transducidas por las vías Sch9, Ras y TOR, es importante para la prolongación de vida inducida por inanición [ 31 ], mientras que en el gusano de nematodo Rheb-1, con un rol clave en la señalización TOR, es esencial para los efectos pro longevidad de IF [ 32 ]. Curiosamente, los hallazgos con ambos organismos implican la existencia de mecanismos subyacentes adicionales que median los efectos pro-longevidad de la IF. No está claro si Rim15 / Rheb-1 y sus interactores median los efectos de IF en mamíferos.
Estudios previos que examinaron los posibles efectos pro-longevidad de la IF en las moscas han producido resultados principalmente negativos [ 26 , 33 , 34 ]. Los primeros estudios, hace casi 90 años, descubrieron que 6 horas de inanición en cada 24 horas eran beneficiosas y podían alargar la vida [ 34 ]. Sin embargo, los efectos de este régimen de FI pueden ser específicos de cepa o alimento, porque un experimento similar más riguroso 80 años más tarde descubrió que los episodios diarios de inanición de 3 o 6 horas a lo largo de la vida adulta de la mosca no tuvieron un efecto positivo. ni un efecto negativo en la vida útil [ 26 ]. Curiosamente, el ayuno a corto plazo puede aumentar la resistencia al estrés por frío severo [ 35 ] y facilitar la formación de memoria a largo plazo en las moscas [ 36 ]. La alimentación restringida por tiempo (TRF) en Drosophila mejora la consolidación del sueño y una variedad de funciones de gasto cardíaco que normalmente disminuyen con la edad, a pesar de que la ingesta / gasto calórico de moscas TRF es la misma que la mosca alimentada ad libitum [ 37 ]. Por lo tanto, las mejoras en la salud pueden ser el resultado de varios regímenes de IF en Drosophila , pero los mecanismos en funcionamiento aguardan la elucidación y la evidencia de un fenotipo de pro-longevidad de IF es más mixta.
Aquí, investigamos una variedad de regímenes de IF en moscas y sus efectos en una variedad de resultados de salud, que incluyen el comportamiento de alimentación, la salud intestinal y metabólica, la supervivencia después del estrés y la esperanza de vida. Es importante destacar que la IF a corto plazo (la dieta "2: 5") confinada a la vida temprana robustamente aumentó la vida útil subsiguiente, particularmente en las mujeres, independientemente de la señalización TOR. La IF a corto plazo también condujo a mejoras de salud duraderas, que incluyen una mayor resistencia al estrés y una menor incidencia de patología intestinal que se asoció con una reducción de la abundancia bacteriana.

Resultados

SI durante la primera infancia se extiende la vida útil

Presumimos que los períodos de inanición en los regímenes de IF publicados anteriormente pueden haber sido insuficientes en duración para influir en la supervivencia [ 26 ]. Por lo tanto, comenzamos ayunando moscas femeninas exponiéndolas a gel de agar sin nutrientes durante 5 días consecutivos por semana (5 días IF-la dieta 2: 5) durante toda la vida y descubrimos que esto conducía a un inicio más temprano de mortalidad relacionada con la edad y acortó significativamente la esperanza de vida en comparación con los controles alimentados ad libitum ( Figura 1 A). Las tasas de mortalidad fueron menores durante los períodos de alimentación de 2 días en las moscas IF, un efecto que persistió en los primeros 3 días después de la retirada de los alimentos. Debido a que 5 días de inanición continua fueron perjudiciales, seguidamente investigamos los efectos de 5 días de ayuno no continuo por 7 días ayunando durante 3 días, alimentándolos durante 1 día, ayunando durante 2 días y alimentándolos durante 1 día y descubriendo que este régimen también acortó significativamente la esperanza de vida, aunque con un leve efecto protector hasta el día 50 ( Figura S1A). Tomado en conjunto con la observación de que el IF continuo de 5 días no comenzó a inducir la mortalidad hasta que las moscas tenían ~ 30 días de edad ( Figura 1 A), estos hallazgos sugieren que los efectos del IF pueden ser específicos de la edad. La tasa de alimentación de moscas disminuye con la edad [ 38 ], y las moscas más viejas pueden por lo tanto ser más sensibles a la inanición y al agotamiento de las reservas de energía. Cualquier efecto beneficioso de IF puede, por lo tanto, perderse o incluso revertirse más tarde en la vida.
Para evaluar directamente el beneficio de IF específico para cada edad, repetimos el experimento IF continuo de 5 días e incluimos un grupo IF adicional que regresó a alimentación ad libitum después de 30 días del régimen IF (denominado "interruptor IF"). La esperanza de vida se acortó de nuevo mediante una IF continua de 5 días durante toda la vida ( Figura 1 B), pero el grupo de cambio de IF tuvo una esperanza de vida significativamente más prolongada en comparación con los controles ad libitum . Una repetición independiente de este experimento confirmó estos resultados ( Figura S1 B). Por lo tanto, la exposición continua a la dieta 2: 5 indujo la mortalidad en moscas viejas, pero el mismo régimen dietético durante los primeros 30 días de vida adulta dio como resultado una prolongación significativa de la vida en las moscas hembra, lo que indica un efecto de "memoria" duradero de esta etapa temprana. intervención de vida.
Los regímenes de IF menos severos también pueden dar como resultado resultados positivos en comparación con la IF continua de 5 días. Por lo tanto, a continuación, examinamos los efectos de los períodos de duración de ayuno más cortos con IF continuas de 2 días, 3 días y 4 días durante toda la vida adulta. Ninguno de estos regímenes tuvo un efecto significativo en la esperanza de vida ( Figuras S2 A-S2C). Cuando se examinaron los mismos regímenes con una condición de interruptor de IF adicional, el interruptor de IF de 2 días y 4 días no tuvo un efecto significativo, mientras que la condición de interruptor IF de 3 días vivió significativamente más tiempo ( Figuras S2 D-S2F). Aumentar el contenido calórico de los alimentos es otra manera de compensar la severidad potencial de la IF. Cuando las moscas fueron alimentadas con dos veces la cantidad de levadura ("2SY") [ 39 ], el ayuno durante 2 días por semana a lo largo de la vida adulta aumentó significativamente la esperanza de vida ( Figura S2 G).
Para descartar la especificidad de la cepa de nuestros resultados, realizamos IF en la cepa de laboratorio isogénico 1118 . La esperanza de vida se extendió significativamente en 1118 después de 30 días de IF de 5 días ( Figura 1 C). 1118hembras mostraron inicialmente una mayor sensibilidad a IF de 5 días en comparación con moscas Dah exógamas ( Figuras 1 A y 1B), por lo que, para descartar un sesgo de selección para las moscas más resistentes a la inanición, también aplicamos IF de menor duración a estas moscas Mientras que el interruptor IF de 3 días no tuvo un efecto significativo ( Figura S3 A), el interruptor IF de 4 días alargó significativamente la vida útil en 1118 moscas ( Figura S3 B). Es importante destacar que la mortalidad temprana de la vida desapareció en estas moscas, mientras que el fenotipo de longevidad se mantuvo.
Las moscas macho también se beneficiaron del régimen de cambio IF. Las moscas macho son más sensibles al hambre que las hembras [ 40 ]. Por lo tanto, los machos estuvieron expuestos a IF de 4 días durante 25 días. Esto dio como resultado una extensión de la vida útil significativa ( Figura 1 D). También evaluamos FI de 2 días y IF de 3 días en hombres, pero no hubo ningún efecto ( Figuras S3 C y S3D). Por lo tanto, ambos sexos pueden beneficiarse de una intervención dietética temprana con mayor longevidad, y estos efectos dependen de la duración del período de ayuno.

La extensión de la vida útil por IF no está mediada por una disminución de la fecundidad

IF indujo una mayor extensión de vida útil en las moscas hembra en comparación con los hombres. Nuestra hipótesis es que esto puede deberse a la reducción de la fecundidad, un sello distintivo de las intervenciones pro-longevidad, como la RD [ 26]. Por lo tanto, realizamos recuentos de huevos durante el período de ayuno / alimentación. La fecundidad prácticamente se abolió durante el período de ayuno y se restauró después de volver a alimentarse ( Figura S1 C).
Debido a que la dieta 2: 5 redujo la producción de huevos, probamos experimentalmente el papel de la fecundidad reducida en el aumento de la longevidad de la IF. Realizamos FI en hembras vírgenes, que producen menos huevos que las hembras apareadas [ 41 ], y en hembras estériles portadoras de la mutación dominante de ovo D , que bloquea la ovogénesis [ 42 ]. La esperanza de vida se extendió significativamente en virgen Dah mujeres después de IF ( Figura 1 E). Además, mientras que ovo D hembras inicialmente mostraron una mayor sensibilidad a 5-días si se compara con outbred Dah moscas (ver Figuras 1 A y 1B), 5-días si el interruptor ovo D moscas vivieron significativamente más tiempo que los controles ( Figura 1 F). Para descartar un sesgo de selección para las moscas Ovo D más resistentes a la inanición , también realizamos IF de menor duración en estas moscas. Mientras que el interruptor IF de 3 días in ovo D moscas no tuvo un efecto significativo en la vida útil ( Figura S3 E), el interruptor IF de 4 días alargó significativamente la vida útil ( Figura S3 F) pero sin exceso de mortalidad temprana. Por lo tanto, de forma similar a DR [ 43 ], el fenotipo de pro-longevidad observado después de la IF a corto plazo de la vida temprana no está mediado por una fecundidad reducida.

Efectos de IF son duración y edad específica

El ayuno de días alternos (EOD) consiste en alternar alimentación / ayuno en días consecutivos y es menos severo que 5 días de ayuno continuo. Realizamos EOD en ayunas durante los primeros 30 días de vida (interruptor EOD) y no encontramos ningún efecto en la vida útil en comparación con los controles ad libitum , mientras que el interruptor IF de 5 días aumentó significativamente la esperanza de vida ( Figura 1 G). A continuación, investigamos la duración óptima de IF de vida temprana para la extensión de la vida útil de las moscas hembra. Ni 10 ni 20 días de IF prolongada de vida de 5 días ( Figuras 2 A y 2B), mientras que 30 días ( Figura 2C), 40 días ( Figura 2 D) y 45 días de IF de 5 días ( Figura 2 E) todos lo hicieron. 50 días de 5 días IF extensión de vida útil ligeramente reducida en comparación con 45 días ( Figura 2 F). Además, 50 días de la dieta de FI provocaron una muerte prematura antes de que el IF cambiara a condiciones ad libitum . Por lo tanto, parece haber una ventana específica de la duración y específica de la edad donde IF puede ejercer sus efectos beneficiosos.

SI está restringido a la vida media IF también puede prolongar la vida útil

Para evaluar los efectos de la IF en etapas distintas a las de la edad adulta temprana, también examinamos el efecto de una IF de "mediana vida" y "de vida tardía" en la esperanza de vida. Una vez más, observamos una prolongación significativa de la duración de la vida en el cambio de IF a 5 días después de los 30 días del régimen en la adultez temprana ( Figura 2 G). Para realizar un cambio IF de vida media, las moscas se mantuvieron en comida ad libitum durante los primeros 20 días de vida adulta, se pasaron a IF de 5 días de los días 20 a 45 (25 días del régimen) y luego se volvieron a colocar ad libitum comida por el resto de la vida adulta. Observamos una prolongación de la vida útil significativa en las moscas de cambio IF de mediana edad en comparación con los controles ad libitum , aunque hubo una notable mortalidad antes de volver a cambiar a alimento ad libitum . A continuación, evaluamos el efecto del IF de vida tardía en la esperanza de vida. El cambio Dah vuela a IF 5 días después de 30 días de comida ad libitum acorta significativamente la duración de la vida ( Figura S3 G), lo que indica que los efectos pro longevidad de IF se ejercen durante los primeros años de vida y, en menor medida, en la mitad de la vida.

SI aumenta la resistencia al estrés

La mayoría de las intervenciones a favor de la longevidad en las moscas se acompañan de incrementos en las respuestas al estrés [ 44 ], incluida la resistencia al hambre. Realizamos un ensayo de inanición en hembras post-IF de 42 días ( Figura S3 H) y descubrimos que las moscas previamente expuestas a IF vivieron significativamente más tiempo. A continuación examinamos los efectos del diclorodifeniltricloroetano (DDT), una toxina xenobiótica, y el paraquat, un estrés oxidativo, en la supervivencia de las hembras post-IF de 42 días ( Figuras S3 I y S3J). A partir de dos estudios replicados independientes, las moscas post-IF exhibieron una resistencia pequeña pero significativamente mejorada al DDT y al paraquat. Por lo tanto, la FI temprana puede conducir a una resistencia al estrés de larga duración. Las moscas post-IF que fueron alimentadas con DDT y paraquat mostraron una mayor resistencia a estas toxinas, y la hipótesis de que los efectos protectores de la IF pueden deberse, al menos en parte, a mejoras en la salud intestinal. Por el contrario, aunque DR se asocia con un aumento de TAG y la resistencia al hambre [ 45 ], DR no aumenta la resistencia xenobiótica en las moscas, y por lo tanto IF es distinta de DR en este sentido [ 46 ].

La ingesta acumulada de alimentos no se reduce durante el SI y aumenta después del cambio de IF

Las moscas expuestas al régimen de SI de 5 días se alimentan durante 2 días a la semana. Presumimos la siguiente extensión de la esperanza de vida observada en las moscas interruptor IF podría deberse a una reducción global de toda la vida en la ingesta de calorías, como en DR. Por lo tanto, examinamos el efecto de IF sobre la ingesta total de alimentos mediante la realización del ensayo cuantitativo de alimentación capilar (CAFE) ( Figuras S4 A-S4C). Durante el período de alimentación de 2 días, las moscas IF a 5 días ingirieron significativamente más alimento que los controles ( Figura S4 A). Sin embargo, después de 14 días, no hubo diferencias significativas en la ingestión acumulada de alimentos entre las moscas IF y los controles ( Figuras S4 B y S4C).
También examinamos el comportamiento de alimentación post-IF utilizando el ensayo CAFE y comenzamos a medir a los 6 días después del cambio de IF. La ingesta acumulada de alimentos fue significativamente mayor en las moscas IF en comparación con los controles ad libitum ( Figura S4 D). Llegamos a la conclusión de que la ingesta acumulada de alimentos no se redujo significativamente durante la IF, mientras que la alimentación se incrementó después de la IF. Por lo tanto, la extensión de la duración de la vida inducida por IF no se debió a una reducción similar a la DR en la alimentación total post-IF.

SI reduce el contenido de lípidos, con recuperación después de la IF

El ayuno desencadena la movilización de las reservas de grasa internas, que pueden permitir a los animales sobrevivir durante períodos prolongados de inanición. Por lo tanto, realizamos un experimento de curso de tiempo que mide triacilglicéridos de mosca completa (TAG) a partir de moscas conmutadas IF de 5 días. También examinamos moscas que permanecieron en el régimen de FI de 5 días. Bajo condiciones ad libitum , los niveles de TAG aumentaron con la edad y se estabilizaron alrededor del día 37 ( Figura S4 E). Por el contrario, las moscas IF de 5 días tuvieron niveles de TAG significativamente reducidos cuando estaban completamente en ayunas. En el día 37, los niveles de TAG en las moscas interruptor IF no se habían recuperado completamente a niveles ad libitum . Sin embargo, los niveles de TAG en las moscas interruptor IF se recuperaron a niveles ad libitum a partir del día 46 (es decir, 2 semanas después del cambio a alimento ad libitum ). Examinamos los niveles de TAG en mujeres de 60 días (es decir, 30 días desde el final de la dieta de IF). Los niveles de TAG de mosca completa fueron significativamente más altos en las moscas conmutadas IF en comparación con loscontroles ad libitum ( Figura S4 G). Los niveles de TAG en el día 60 a partir de moscas de cambio IF de 3 días, 4 días y 5 días también se examinaron. Los niveles de TAG fueron significativamente más altos en el interruptor IF de 5 días solo en comparación con las otras condiciones ( Figura S4 H), destacando una posible explicación del mayor efecto pro-longevidad del interruptor IF de 5 días en comparación con IF de 3 o 4 días cambiar.
Los niveles de proteína de mosca entera no fueron significativamente diferentes entre ninguna de las condiciones probadas ( Figuras S4 F-S4H). Por lo tanto, la reducción en los niveles de TAG durante el período de FI de 5 días se recuperó y se estabilizó a niveles ad libitum después de la IF. De hecho, parece que TAG se estaba acumulando en moscas conmutadas IF de 5 días. El aumento de los niveles de TAG a los 60 días puede indicar un mecanismo detrás de la larga vida útil del interruptor IF.

SI conserva la homeostasis intestinal y está asociado con una reducción de la abundancia bacteriana

Se ha demostrado que el mantenimiento de la homeostasis intestinal desempeña una función importante en la determinación de la esperanza de vida en Drosophila [ 29 , 47 , 48 ]. La homeostasis del tejido del intestino medio es mantenida por las células madre intestinales (CSI), que están dispuestas a lo largo de la membrana basal y responden al estrés y conducen a una respuesta regenerativa. En el envejecimiento del intestino femenino de la mosca, la proliferación de ISC se desregula y puede conducir a una mala diferenciación e hiperplasia en el intestino. DR reduce la patología intestinal en las mujeres de edad [ 29 ], y por lo tanto, tratamos de examinar los efectos de la IF sobre la homeostasis intestinal.
Examinamos la región del intestino medio R4 de hembras de 70 días y comparamos condiciones de cambio ad libitum , IF de 5 días e IF. Los ISCs mitóticamente activos se visualizaron mediante inmunotinción con fosfohistona H3 (pH3). Las hembras alimentadas con ad libitum exhibieron una actividad de ISC generalizada, mientras que las hembras IF de 5 días completamente ayunadas tenían significativamente menos células positivas para pH3 ( Figuras 3 A y 3B), lo que indica quiescencia de ISC. Notablemente, después de 40 días desde el cambio a alimento ad libitum , las moscas conmutadas IF todavía tenían significativamente menos células positivas para pH3 en comparación con los controles ad libitum . La longitud de la tripa fue significativamente más corta en hembras IF de 5 días completamente ayunadas en comparación con controles ad libitum ( Figura 3 C). SI las tripas de los interruptores, sin embargo, no fueron más cortas que las de los controles ad libitum . También medimos el ancho de las regiones R4 de cada intestino ( Figura 3 D) y encontramos que, después de 5 días de ayuno, las tripas de SI a los 5 días de edad fueron significativamente más estrechas que los controles ad libitum . SI las agallas del interruptor no eran más angostas que los controles ad libitum . Por lo tanto, la patología relacionada con la edad del aumento de la actividad de las células madre en las tripas viejas de las mujeres, medida por la tinción de pH3, fue rescatada por la intervención de IF a corto plazo en la vida temprana. Esta protección parecía ser de larga duración y no se debía a cambios morfológicos o estructurales importantes en el intestino.
A continuación, examinamos la patología intestinal en las regiones R2 y R4 del intestino medio de mujeres de 70 días de edad y comparamos condiciones de cambio ad libitum , IF de 5 días e IF. En las regiones R2 / R4 de las tripas femeninas jóvenes, los núcleos se organizan típicamente en un epitelio de capa única, mientras que en las mujeres ancianas, el epitelio puede exhibir varias capas de núcleos, lo que indica trastornos y patologías generalizados [ 29 ]. Las patologías se puntuaron a ciegas, se agruparon en categorías escaladas y se cuantificaron. Las hembras ad libitum de 70 días exhibieron varias capas de núcleos en los epitelios del intestino medio R2 y R4, indicando una patología generalizada, mientras que las hembras de IF de 5 días completamente ayunadas tenían una patología reducida, particularmente en la región del intestino medio R2 ( Figuras 3 E-3G) . De forma similar a la actividad de ISC, las moscas conmutadas IF redujeron notablemente la patología midgut R2 y R4 en comparación con los controles ad libitum . Esto confirma el efecto protector del IF a corto plazo en la vida temprana sobre las patologías intestinales similares a tumores relacionadas con la edad en las mujeres.
Como una lectura funcional de la homeostasis intestinal, medimos la función de la barrera intestinal utilizando el ensayo smurf [ 48 ]. En moscas jóvenes, colorante azul FD & C no. 1 normalmente no pasa a través del intestino a la cavidad del cuerpo, pero en una pequeña población de moscas viejas, el tinte azul puede pasar a través de la barrera intestinal y hacer que las moscas se vuelvan azules (o "smurf"). Encontramos que había significativamente menos moscas conmutadas IF de 60 días que smurfed en comparación con los controles ad libitum ( Figura 3 H), lo que indica una mejor función de barrera intestinal debido a la IF.
La integridad de la barrera intestinal está vinculada a la disbiosis microbiana con la edad [ 49 , 50 ], y la eliminación de bacterias en la adultez tardía extiende la esperanza de vida [ 51 ]. También se sabe que la dieta y el programa de transferencia de alimentos voladores afectan la diversidad y abundancia de bacterias asociadas a la mosca, y se puede esperar que el régimen de ayuno que realizamos module la microbiota asociada. Por lo tanto, comparamos la abundancia bacteriana relativa en hembras enteras de 40 días (es decir, día 10 post IF) por qPCR del gen 16S rRNA bacteriano con pan bacterial y cebadores específicos de Lactobacillus - plantarum . L. plantarum fue elegido ya que es uno de los comensales más abundantes en la mosca adulta, y también recientemente se asoció con la pérdida de la integridad del epitelio intestinal en adultos [ 52 ]. La abundancia bacteriana relativa se redujo significativamente en las moscas interruptor IF en comparación con los controles ad libitum utilizando cebadores pan bacterial y L. plantarum ( Figura 3 I).
La dieta 2: 5 así protegida contra el deterioro relacionado con la edad de la homeostasis intestinal femenina, medida por la actividad ISC reducida sin cambios ultraestructurales importantes, y con una reducción de las patologías tipo tumor en ambas regiones R2 / R4, protegida contra la pérdida de intestino función de barrera y condujo a una carga bacteriana reducida.

SI actúa independientemente de la vía TOR

Presumimos que los efectos beneficiosos de IF en la vida útil estaban actuando, al menos en parte, a través de la vía TOR. IF apareció como fenocopía de muchos de los efectos beneficiosos sobre la esperanza de vida, la resistencia al estrés y la salud intestinal observados con la señalización TOR reducida [ 53 , 54 ]. De hecho, se ha demostrado que la señalización TOR reducida prolonga la longevidad en una variedad de organismos [ 27 ]. Además, la rapamicina puede extender la vida útil de Drosophila más allá del máximo alcanzado por la RD [ 53 ], lo que indica que los efectos de la rapamicina son parcialmente independientes de los de la RD. Debido a que los efectos de la rapamicina y la DR sobre la vida útil son aditivos, examinamos si IF y rapamicina también eran aditivos.
Primero examinamos el efecto de la administración de rapamicina después de 30 días del régimen de FI y los comparamos con los controles de IF vehículo (EtOH) e IF ( Figura 4 A). Encontramos que los efectos de prolongación de la duración de la vida de la rapamicina y el IF fueron aditivos, lo que indica mecanismos distintos. Usando una configuración experimental diferente, en lugar de administrar rapamicina después del período de vida temprana de IF, administramos la rapamicina a las moscas durante toda la vida útil ( Figura 4 B). En comparación con los controles ad libitum no tratados ad libitum rapamycin y IF cambian tanto la vida útil extendida en una medida similar. Durante el régimen de FI, las moscas tienen acceso a los alimentos durante 2 días a la semana, por lo que para controlar la rapamicina en ayunas durante el período de "alimentación" de 2 días, también agregamos una condición ad libitum en la que solo tomamos rapamicina durante el 2do. período de alimentación diurna Observamos una extensión de la vida pequeña pero significativa en moscas alimentadas con rapamicina 2 días por semana en comparación con controles ad libitum no tratados La rapamicina protegía contra los efectos nocivos de la IF de por vida. El tratamiento con rapamicina durante el período de alimentación de 2 días de la dieta de cambio de IF luego ad libitum apartir de entonces dio como resultado un aumento en la esperanza de vida en comparación con la condición de interruptor de IF sin tratar. De manera similar, para las moscas tratadas con rapamicina durante el período de alimentación de 2 días de la dieta de cambio IF luego de la rapamicina ad libitum a partir de entonces, la esperanza de vida aumentó en comparación con la condición de interruptor IF no tratado. En comparación con las esperanzas de vida ya extendidas de interruptor FI o tratamientos de la rapamicina sola, moscas que fueron expuestos a ambos si y rapamicina, ya sea con ad libitum alimento o ad libitum rapamicina durante el periodo post-SI, prolongar la vida útil aún más en un grado similar. El análisis de riesgos proporcionales de Cox de la esperanza de vida no encontró una interacción significativa entre la IF y la rapamicina, lo que indica que la IF y la rapamicina tienen efectos independientes sobre la esperanza de vida. Por lo tanto, los efectos de IF de la vida y de la rapamicina son aditivos, lo que indica mecanismos no superpuestos.
Para dilucidar aún más los mecanismos que median los efectos de prolongación de la vida de IF, también realizamos experimentos de epistasis genética. S6K facilita los efectos descendentes de TOR por sus efectos sobre la traducción de proteínas, y la extensión de vida inducida por rapamicina se demostró abrogada por su regulación positiva [ 53 ]. Por lo tanto, examinamos los efectos de IF sobre moscas que expresan ubicuamente una forma constitutivamente activa de S6K ( UAS-S6K STDETE ) [ 55 ]. En dos experimentos independientes, encontramos que IF condujo a una prolongación de la vida útil significativa en Da-GAL4 solo-conductor heterocigotos en comparación con controles ad libitum , mientras que la sobreexpresión ubicua de la constitutivamente activa S6K no abolió los efectos de extensión de vida de IF ( Figura 4 C ) El análisis de riesgos proporcionales de Cox de los datos de vida útil agrupados no encontró interacción significativa entre IF y S6K. Por lo tanto, podemos concluir que IF no es epistático con, y está actuando independientemente de, TOR.

Discusión

El IF puede ser altamente efectivo contra enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo diabetes, cáncer y enfermedades cardiovasculares [ 6 ]. Aunque la investigación sobre IF aún está en su infancia, comienzan a descubrirse los mecanismos que median en las mejoras de salud observadas durante y después de la IF.
En este estudio, aclaramos los efectos de la IF sobre la salud y la esperanza de vida en Drosophila . De acuerdo con estudios previos [ 26 , 33 ], encontramos que el IF para periodos cortos de ayuno durante la duración de la vida adulta de la mujer no tuvo ningún efecto beneficioso (p. Ej., 2 días de ayuno por semana). SI se acortó la esperanza de vida cuando se alargó el período de ayuno, por ejemplo, 5 días de ayuno por semana (la dieta de 2: 5). Sin embargo, cuando las moscas se cambiaron a condiciones ad libitum después de 30 días de un régimen prolongado de FI, la esperanza de vida media podría extenderse hasta en un 10%. El efecto pro-longevidad del IF a corto plazo específico de la edad no fue específico al sexo pero fue más efectivo en las mujeres, fue consistente en un rango de genotipos, no se debió a una reducción tipo DR en la ingesta de alimentos después de la IF, y no dependía de la reducción de la fecundidad, lo que indica mecanismos distintos de las compensaciones reproductivas.
Sorprendentemente, IF durante la edad adulta temprana, y también durante la mitad de la vida, fue suficiente para extender la esperanza de vida, lo que indica un efecto de "memoria". El aumento de la resistencia a múltiples tensiones después de la IF también fue una indicación de una salud general significativamente mejorada. La hormona es un fenómeno por el cual el estrés tóxico de "bajo nivel" provoca mecanismos de respuesta que protegen contra tensiones similares pero de mayor nivel asociadas con el envejecimiento [ 56 ]. Dado que la inanición intermitente en los primeros años de vida condujo a una mayor resistencia al hambre después de la IF, además de una mayor esperanza de vida, la hormesis podría desempeñar un papel. Aunque no podemos descartar la posibilidad de un efecto hormonal de la IF, el efecto pro-longevidad de la IF restringido a la vida media y temprana, y el efecto opuesto de acortamiento de la vida de la IF restringido a la vida tardía, sugiere un efecto específico de la edad de SI y que otros mecanismos pueden ser más relevantes. Es necesario seguir trabajando para dilucidar los posibles efectos hormémicos de la IF, así como la evaluación de las intervenciones de longevidad durante las etapas específicas de la vida de la mosca, particularmente las intervenciones tempranas versus tardías, ya que este sigue siendo un área poco explorada de la investigación del envejecimiento [ 57 ].
El aumento de los niveles de TAG, la resistencia al estrés y la longevidad también son potencialmente una consecuencia directa de la hiperfagia post-IF. Curiosamente, las moscas de cambio SI de 42 días de edad eran más resistentes a la inanición en comparación con los controles ad libitum , pero tenían niveles de TAG más bajos, lo que indica un mecanismo diferente al aumento del almacenamiento de grasa. Sería necesario un estudio más detallado del comportamiento alimentario durante el IF y el post-IF para investigar esta hipótesis.
SI influyó en el intestino femenino, con una clara mejora en las medidas de la patología relacionada con la edad, incluida la preservación del fenotipo "juvenil", es decir, la reducción de la actividad de CAI; menos capas de núcleos, lo que indica una reducción en la formación de tumores; y una mejor función de barrera intestinal [ 29 ]. Sin embargo, la longitud del intestino y el ancho del intestino no fueron diferentes de los controles, lo que sugiere una recuperación de la funcionalidad intestinal sin efectos de confusión de las tripas más cortas / más angostas, lo que puede resultar en DR indirecta (funcional). De hecho, el aumento en el contenido de lípidos en las moscas de 60 días a pesar del ayuno temprano apunta a un efecto protector del declive relacionado con la edad en la función intestinal. Sin embargo, es necesario realizar un análisis más profundo que pruebe la capacidad de absorción del intestino durante el envejecimiento antes de poder mejorar la salud y la absorción del intestino. El aumento de los niveles de TAG observado en el interruptor IF de 5 días vuela, pero no en las moscas interruptor IF de 3 o 4 días, también puede explicar la efectividad diferente de cada uno de estos regímenes.
También se observa un aumento de TAG con la pérdida de bacterias asociadas a la mosca [ 58 ], lo que es consistente con los cambios en la TAG observados con las moscas interruptor IF. Por lo tanto, medimos la abundancia bacteriana relativa en hembras post-IF y descubrimos que, a pesar de la mayor ingesta de alimentos posterior a la IF, la abundancia bacteriana relativa se reducía en las moscas interruptor IF. Períodos más largos de ayuno parecen reducir la carga bacteriana total, y esto se asocia con una mejor salud intestinal y una mayor duración de la vida. Sin embargo, se requiere un trabajo adicional para dilucidar si los efectos beneficiosos de la IF se deben a la reducción de la carga microbiana y debe evaluar si la IF conduciría a una mayor longevidad en condiciones libres de gérmenes.
Finalmente, probamos los mecanismos subyacentes a las propiedades pro-longevidad de IF. Se realizó un análisis epistático farmacológico y genético para demostrar que IF actúa independientemente de la vía TOR, ya que la rapamicina y el régimen IF actuaron de forma aditiva para prolongar la vida útil. Del mismo modo, Bjedov y colegas [ 53 ] encontraron que los efectos pro-longevidad de la rapamicina y la RD eran aditivos. La expresión global de un S6K constitutivamente activo no atenuó la extensión de la longevidad inducida por IF, mientras que los efectos de extender la vida útil de la rapamicina fueron abolidos por este método [ 53 ]. Nuestros resultados coinciden con los hallazgos en levaduras y nematodos que la prolongación de la vida inducida por IF puede actuar independientemente de la señalización TOR [ 31 , 32 ]. Cabe señalar que no recomendaríamos la dieta 2: 5, ciclos de 5 días consecutivos de ayuno solo con agua por semana, en humanos.
En resumen, hemos generado y optimizado un régimen confiable y robusto de IF para la extensión de la vida útil de las moscas. Llegamos a la conclusión de que el IF durante la vida temprana puede aumentar la vida de manera robusta de manera independiente de TOR y probablemente actúa preservando la salud intestinal. Es importante destacar que los efectos beneficiosos de la FI a corto plazo fueron duraderos, lo que indica que incluso períodos breves de FI pueden tener beneficios para la salud de larga duración, un fenómeno que debería estar sujeto a una mayor investigación en mamíferos.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a la Dra. Elizabeth Skinner por sus útiles comentarios y al Dr. Nathan Woodling por su ayuda con las estadísticas. Agradecemos a los miembros de los laboratorios Partridge y Gems por las útiles discusiones. Este trabajo fue financiado por un premio estratégico Wellcome Trust (098565).